白细胞介素1β和白细胞介素17在根尖周病组织肥大细胞上的表达*

施庆颜， 靳 华， 曾靖华， 邝少华， 黄世光△

慢性根尖周病是一种以炎症破坏为特征的疾病，炎症性骨吸收是由根尖周组织中的免疫活性细胞或炎症细胞分泌的各种细胞因子(cytokine，CK)介导。研究显示IL-1β和IL-17在关节炎和牙周炎中起关键作用［1-2］，同时 IL-1β和IL-17也存在于根尖周病变组织中［3-4］。尽管进行了大量的实验及临床研究，但是参与根尖周病发生和疾病持续的免疫细胞和CK尚未阐明，参与根尖周病的IL-1β和IL-17的表达还不清楚。传统认为肥大细胞(mast cells，MCs)是过敏性炎症反应的主要效应细胞，除了在过敏性炎症反应中起作用外，MCs还可通过众多介质的表达既参与IgE依赖又参与IgE非依赖的免疫反应［5］。近年来的研究发现MCs是重要的效应和调节性免疫细胞，在固有免疫和适应性免疫反应中均有重要作用［6］。关于MCs的CK参与根尖周病尚无文献报道。因此，本文采用免疫荧光双染色法，观察不同类型慢性根尖周病中MCs的分布情况并分析MCs细胞因子IL-1β及IL-17的表达情况，研究结果对于阐明MCs细胞因子IL-1β及IL-17在根尖周病发病机制中的作用具有理论意义及临床指导价值。

材料和方法

1 研究对象

1.1 病例选择 选择2007年7月至2013年6月期间在暨南大学第一附属医院口腔医学中心临床诊断为根尖囊肿和根尖肉芽肿，并接受根尖刮治手术的病例。根尖肉芽肿和根尖囊肿的病例由暨南大学第一附属医院病理科的2名病理医生从资料库的100例根尖周病病例中挑出，病理诊断为根尖肉芽肿32例(年龄24～65岁，平均40.2岁)、根尖囊肿35例(年龄20～58岁，平均38.9岁)，排除急性炎症和其它疾病。对照组35例(年龄17～24岁，平均21.5岁)为正常牙周膜，来自2013年12月期间在暨南大学医学院附属惠州口腔医院牙周健康的因正畸需要拔除的前磨牙，这些前磨牙牙根发育完全并且没有根尖及牙周病变。所有患者均没有系统性疾病而且至少2个月前停止使用抗生素。在样本收集之前取得患者的书面知情同意书。

1.2 实验分组 本研究共收集样本102例，分为(1)根尖肉芽肿组:X线显示患牙根尖周有圆形或椭圆形密度降低区，直径＜1 cm，边界清楚，组织学检查见明显的炎症细胞浸润，并无鳞状上皮衬里，共32例;(2)根尖囊肿组:X线显示患牙根尖周有圆形或椭圆形密度降低区，直径＞1 cm，边界清楚有骨白线包绕，组织学检查见根尖区组织存在部分或全部上皮覆盖，囊肿表现为完整的囊腔，囊腔为一定厚度的复层鳞状上皮覆盖，囊壁存在纤维组织并有中-重度的炎症细胞浸润，共35例;(3)正常对照组:因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙牙周膜，共35例。

2 方法

2.1 组织标本采集和处理 正常对照组标本取自因正畸需要拔除的前磨牙，用无菌刀片将牙周膜从牙根上刮取，样本立即固定于4%中性甲醛缓冲溶液中48 h以上。经脱水、透明、浸蜡、包埋，制备成5 μm厚度组织连续切片。根尖肉芽肿和根尖囊肿为保存石蜡块，选取符合要求的标本进行组织连续切片。

2.2 HE染色及组织学观察 组织切片经HE染色，光学显微镜下观察各组标本的组织学改变。由2名病理医师盲法观察，并对根尖肉芽肿、根尖囊肿病变组织以及正常对照组健康牙周膜组织的炎症程度进行评分，求其平均值。炎症程度评分标准参照Huang等［7］的方法:0，无炎症细胞浸润;1，轻度炎症，炎症细胞局部呈小灶状浸润;2，中度炎症，炎症细胞呈灶状及片状浸润;3，重度炎症，炎症细胞呈弥漫性浸润。

2.3 IL-1β和IL-17阳性肥大细胞免疫荧光双染色

Ⅰ抗:tryptase抗体(Abcam)，稀释浓度为1∶200;IL-1β(Santa Cruz Biotechnology)和 IL-17抗体(Abcam)稀释浓度为1∶100。Ⅱ抗:山羊抗鼠IgG(H+L)Alex Flour 555®和山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour 488®(Cell Signaling Technology)，稀释浓度为1∶200。组织切片经过常规脱蜡、乙醇复水，柠檬酸盐缓冲液微波抗原修复、山羊血清封闭，Ⅰ抗孵育，避光条件下Ⅱ抗孵育荧光染色后，立即在荧光显微镜下观察。Tryptase免疫荧光阳性信号为绿色荧光，IL-1β和IL-17均显示红色荧光，定位于细胞核或细胞浆，同一视野下tryptase绿色荧光分别与IL-1β和IL-17红色荧光重叠后为橘黄色荧光。由2名病理医师于免疫荧光显微镜下观察到MCs均表达有IL-1β和IL-17，从而对各组实验标本中IL-1β和IL-17阳性的 MCs计数并计算各组IL-1β和IL-17阳性MCs密度(mm－2)。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示。不同组间组织炎症程度评分以及多组间每平方毫米 IL-1β和IL-17阳性MCs数目的比较均采用 Kruskal-Wallis检验;采用Nemenyi检验进行3个独立样本两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 组织学观察

正常对照组未见明显炎症细胞浸润(图1A、B);根尖囊肿上皮层可见中、重度炎症细胞浸润:表现为细胞间水肿和以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润(图1C、D);根尖肉芽肿表现为重度炎症反应，可见毛细血管和成纤维细胞增生，有中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞散在浸润;在炎症肉芽组织周围见纤维组织增生，肉芽组织中有泡沫细胞呈灶性分布(图1E、F)。

Figure 1.Histology of the specimens(HE staining).A，B:healthy control group;C，D:periapical cyst group;E，F:periapical granuloma group.A，C，E:×200;B，D，F:×400.图1 各组标本的组织学观察

各组标本组织炎症程度评分比较见图2，结果显示3组标本组织炎症反应程度不同(P＜0.01)，其中根尖肉芽肿组炎症反应程度最高(平均秩为77.00)。Nemenyi检验结果显示:正常对照组与根尖囊肿组组织炎症程度之间存在显著差异(P＜0.01);正常对照组与根尖肉芽肿组组织炎症程度之间有显著差异(P＜0.01);根尖囊肿组与根尖肉芽肿组组织炎症程度无显著差异(P＞0.05)。

Figure 2.Inflammation score in the specimen.A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).Mean±SD.＊＊P ＜0.01 vs A.图2 各组标本组织的炎症程度评分

2 IL-1β阳性MCs免疫荧光双染色结果

各组标本组织中IL-1β阳性MCs免疫荧光双染色结果见图3。结果显示，各组标本组织MCs均表达IL-1β。正常对照组:牙周膜组织中只见少量散在分布的IL-1β阳性MCs(图3A、B、C);根尖囊肿组:组织中IL-1β阳性MCs数目显著增多，且MCs有脱颗粒现象(图3D、E、F);根尖肉芽肿组:组织中出现大量的IL-1β阳性MCs，且MCs伴明显脱颗粒现象(图3G、H、I)。

Figure 3.Representative photomicrographs of MC infiltration with tryptase-IL-1β immunofluorescence double staining(×1 000).A～C:healthy control group;D～F:periapical cyst group;G～I:periapical granuloma group.A，D，G:tryptase;B，E，H:IL-1β;C，F，I:merged.图3 各组标本组织中的IL-1β阳性MCs

各组标本组织中IL-1β阳性MCs密度见图4，结果显示3组标本 IL-1β阳性 MCs密度不同(P＜0.01)，其中根尖肉芽肿组IL-1β阳性MCs密度最高(平均秩为75.09)。Nemenyi检验结果显示:正常对照组与根尖囊肿组IL-1β阳性MCs密度之间存在显著差异(P＜0.01);正常对照组与根尖肉芽肿组IL-1β阳性MCs密度之间有显著差异(P＜0.01);根尖囊肿组与根尖肉芽肿组IL-1β阳性MCs密度无显著差异(P ＞0.05)。

Figure 4.The density of IL-1β positive MCs.M A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).Mean±SD.＊＊P ＜0.01 vs A.图4 各组标本组织中IL-1β阳性的MCs密度

3 IL-17阳性MCs免疫荧光双染色结果

各组标本组织中IL-17阳性肥大细胞免疫荧光双染色结果见图5。结果显示，各组标本组织MCs均表达IL-17。在正常对照组，牙周膜组织中只见少量散在分布的IL-17阳性MCs(图5A、B、C);根尖囊肿组:组织中IL-17阳性MCs数目显著增多，且MCs有脱颗粒现象(图5D、E、F);在根尖肉芽肿组，组织中出现大量的IL-17阳性MCs，且MCs伴明显脱颗粒现象(图5G、H、I)。

各组IL-17阳性MCs密度见图6，结果显示3组标本IL-17阳性MCs密度不同(P＜0.01)，其中根尖肉芽肿组 IL-17阳性 MCs密度最高(平均秩为76.92)。Nemenyi检验结果显示:正常对照组与根尖囊肿组IL-17阳性MCs密度之间存在显著差异(P＜0.01);正常对照组与根尖肉芽肿组IL-17阳性MCs密度之间有显著差异(P＜0.01);根尖囊肿组与根尖肉芽肿组IL-17阳性MCs密度无显著差异(P＞0.05)。

4 IL-1β阳性MCs密度与组织炎症程度相关性分析

Figure 5.Representative photomicrographs of MC infiltration with tryptase-IL-17 immunofluorescence double staining(×1 000).A～C:healthy control group;D～F:periapical cyst group;G～I:periapical granuloma group.A，D，G:tryptase;B，E，H:IL-17;G，F，I:merged.图5 各组标本组织中的IL-17阳性MCs

Figure 6.The density of IL-17 positive MCs.A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).Mean±SD.＊＊P ＜0.01 vs A.图6 各组标本组织中IL-17阳性的MCs密度

各组IL-1β阳性MCs密度与组织炎症程度之间的关系见图7。结果显示，与正常对照组相比，慢性根尖周炎组织炎症程度显著增加(P＜0.01)。同时，随着根尖周组织炎症程度的增加，IL-1β阳性MCs密度也随之增加。经Pearson相关分析及直线回归分析，3组标本组织中IL-1β阳性MCs密度与组织炎症程度密切相关，且存在正的直线相关关系(P＜0.01)。

5 IL-17阳性MCs密度与组织炎症程度相关性分析

各组IL-17阳性MCs密度与组织炎症程度之间的关系见图8。结果显示，与正常对照组相比，慢性根尖周炎组织炎症程度显著增加(P＜0.01)。同时，随着根尖周组织炎症程度的增加，IL-17阳性MCs密度也随之增加。经Pearson相关分析，3组标本组织中IL-17阳性MCs密度与组织炎症程度密切相关，且存在正的直线相关关系(P＜0.01)。

Figure 7.Correlation analysis between density of IL-1β positive MCs and inflammation score.A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).图7 各组标本IL-1β阳性MCs密度与组织炎症程度之间的关系

Figure 8.Correlation analysis between density of IL-17 positive MCs and inflammation score.A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).图8 各组标本IL-17阳性MCs密度与组织炎症程度之间的关系

讨 论

研究表明来源于感染根管的微生物是根尖周疾病的主要病因，根尖周疾病通常伴有根尖周的骨吸收，目前关于根尖周感染致骨吸收的致病机制尚未阐明。体外骨吸收实验结果显示，IL-1β是最活跃的骨吸收因子［8］。有报道指出 IL-1β、IL-1α 和 TNF-α在体内也能刺激骨吸收［9-10］，这些介质在体外也能发挥相似的作用，表明它们在骨吸收性疾病的致病机制中具有潜在的作用。IL-17是一种促炎介质，研究显示IL-17在骨破坏性疾病中显著升高，如类风湿性关节炎和牙周炎［1］，同时 IL-17也存在于根尖周病中［3-4］，表明Th17细胞也可能促进组织破坏，包括根尖周骨破坏。目前，IL-17在根尖周病中的具体作用机制还不清楚［11］。

传统认为MCs是过敏性炎症反应的主要效应细胞，除了在过敏性炎症反应中起作用外，MCs还可通过众多介质的表达既参与IgE依赖又参与IgE非依赖的免疫反应［12］。近年来的研究发现MCs是重要的效应和调节性免疫细胞，对固有免疫和适应性免疫均有重要作用［13］。MCs在根尖周疾病中的作用，目前尚无统一的看法。MCs在根尖肉芽肿和囊肿中均有发现，并且囊肿中MCs比肉芽肿多［14］。de Noronha Santos Netto等［15］在根尖囊肿的炎症病变区观察到肥大细胞数量增多，而且在病变的深层组织中出现明显的脱颗粒MCs，提示MCs与牙源性病变的炎症反应和囊性病变有关。等［16］观察到囊肿MCs数量比肉芽肿多，且MCs主要出现在根尖周病变的炎性浸润和成纤维细胞区域。Ledesma-Montes等［17］观察到在有上皮增生的肉芽肿中MCs增多较多，脓肿部位MCs数量较少，提示MCs与根尖周炎症进程的发生、发展和持续存在密切关系。我们的研究结果显示，根尖肉芽肿和囊肿MCs数量较正常对照明显增多，但MCs数量在肉芽肿和囊肿无明显差异。

根尖周病中活化的MCs既可以分泌IL-1又可以分泌IL-17，尽管IL-1不是作为CTMC中一种预先合成的介质存在［18-19］。MCs的活化以及随之而来的脱颗粒，存在于细胞外环境中的Tryptase能激活MCs释放 IL-1β［20］。IL-1、IL-17 作为一种促炎介质，可引起根尖周组织的炎症反应及破骨细胞生成和骨吸收。

本实验我们采用免疫荧光双染色法首次证实了人类慢性根尖周病组织中的肥大细胞表达IL-1β和IL-17。我们的研究结果显示，慢性根尖周病组织中IL-1β和IL-17阳性MCs数目显著高于正常对照组;同时，随着根尖周组织炎症程度的增加，IL-1β和IL-17阳性MCs密度也随之增加;提示IL-1β和IL-17阳性MCs可能在慢性根尖周炎的致病机制中发挥重要作用。因此，控制MCs IL-1β和IL-17的合成或者调节MCs的功能可能成为阻止根尖周病发展的一个治疗目标，从而为根尖周病的治疗提供新的靶点。

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