RP-HPLC法测定人血浆中的万古霉素浓度

江苏省泰州市中医院（225300）王威 王姝梅 朱春健

万古霉素（Vancomycin）是糖肽类抗生素，抑制细菌细胞壁的合成，临床上主要用于严重的革兰阳性菌感染，特别是耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)、表皮葡萄球菌(MRSE)所致的感染[1]。但万古霉素的治疗指数窄，个体差异大，影响因素多，且具有一定的耳肾毒性[2]，因此对患者进行万古霉素的血药浓度监测尤为重要。

随着分析仪器与分析方法的不断发展，万古霉素血药浓度的测定方法也由探索转为规范。有研究报道，荧光偏振免疫法及高效液相色谱法是目前常用的万古霉素血药浓度测定方法[3]。本研究采用反相高效液相色谱法测定了万古霉素的血药浓度，现汇报如下。

1 资料和方法

1.1 药品与试剂 万古霉素标准品（中国药品生物制品检定所），磷酸氢二钾（分析纯），磷酸（分析纯），硫酸锌（分析纯），乙腈（色谱纯），空白血浆（泰州中医院输血科），水为超纯水。

1.2 仪器日本岛津HPLC仪，LC-20AT泵，SPD-20A紫外检测器，LC-SOLUTION工作站；离心机（上海安亭科学仪器厂）；旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）。

1.3 色谱条件 色谱柱：ODS-C18柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流动相：乙腈-0.0125moL•L-1磷酸二氢钾缓冲液（8 ∶ 92，V/V）；检测波长：236nm；流速：1.0 mL•min-1；柱温：25℃；进样量：10μL。

1.4 标准溶液的配置 精密称取万古霉素标准品12.50mg加超纯水溶解并于25mL量瓶中定容，配成质量浓度为500 mg•L-1的标准品储备液，置冰箱4℃贮存备用。

1.5 流动相的配置 取磷酸二氢钾1.70g加超纯水溶解并于1000mL量瓶中定容，磷酸调pH至3.2，配成0.0125 moL•L-1的磷酸二氢钾缓冲液；取乙腈460mL，磷酸二氢钾缓冲液40mL，混合超声30min。

1.6 10 %硫酸锌溶液的配置 精密称取硫酸锌5.0 g加超纯水溶解并于50mL量瓶中定容，配制成10%硫酸锌溶液，0.22μm微孔滤膜过滤，置4℃冰箱贮存备用。

1.7 血样处理 取200μL空白血浆，加入50μL 10%硫酸锌，旋涡混匀，12000r•min-1离心4min，取上清液10μL进样，记录色谱图。

2 结果

2.1 专属性考察 分别取空白血浆100μL、空白血浆100μL加一定量的标准品溶液、病人用药后血浆100μL，按“1.7”项下方法处理，并按“1.3”项下色谱条件进样测绘HPLC图谱，色谱图见附图。结果表明，血浆中成分不干扰万古霉素的测定。

2.2 标准曲线的绘制 取标准品储备液，用超纯水分别稀释成浓度为5，10，20，40，100，200，400mg•L-1的标准溶液，取空白血浆100μL置于带塞离心管中，加入不同浓度的标准溶液100μL，混匀，使万古霉素的浓度分别为2.5，5，10，20，50，100，200mg•L-1。按“1.7”项下方法处理，并按“1.3”项下色谱条件进样测绘HPLC图谱，记录峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，以万古霉素进样浓度（X，mg•L-1）为横坐标，采用加权(1/C2)最小二乘法进行回归计算，得回归方程Y=9065.1 X - 235.46（r=0.9997， n=7）。结果表明万古霉素进样浓度在2.5～200 mg•L-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

附图 万古霉素（1）的血浆样品色谱图

2.3 精密度测定 分别取空白血浆100μL，加入低、中、高3个浓度的标准溶液100μL，混匀，使万古霉素浓度分别为2.5 mg•L-1，50 mg•L-1，200 mg•L-1，按血样处理和测定方法操作，以1天内每个浓度5个样品测定的万古霉素浓度计算日内精密度，以一周内连续3天测定的万古霉素浓度计算日间精密度。结果低、中、高3个浓度日内RSD分别为3.91%，2.38%，1.77%，日间RSD分别为4.01%，2.35%，1.82%。

2.4 回收率试验 取空白血浆100μL，分别加入低、中、高3个浓度的标准溶液100μL，混匀，使万古霉素浓度分别为2.5mg•L-1，50mg•L-1，200 mg•L-1，每个浓度各配置5个样品，按血样处理和测定方法操作，按标准曲线计算出万古霉素的浓度，并按照公式计算回收率：回收率（%）=测得值/加入值×100%。结果低、中、高浓度的相对回收率分别为99.4%，100.3%和99.2%，RSD分别为2.9%，3.2%，1.8%（n=5）。

2.5 稳定性考察 取空白血浆100μL，分别加入低、中、高3个浓度的标准溶液100μL，混匀，使万古霉素浓度分别为2.5 mg•L-1，50 mg•L-1，200 mg•L-1，每个浓度各配置3个样品，室温放置，于0、1、2、4、6、8、24h，按血样处理和测定方法操作，测定万古霉素的浓度。结果低、中、高浓度的万古霉素峰面积积分值RSD分别为1.47%，1.57%和1.12%，表明万古霉素血浆样品在24h内稳定。

3 讨论

本研究分别考察了磷酸二氢钾溶液-乙腈体系、磷酸二氢钾溶液-甲醇体系以及磷酸二氢钾溶液-乙腈-甲醇体系作为流动相时对万古霉素色谱行为的影响，结果表明，磷酸二氢钾溶液-甲醇体系下，色谱峰宽大且分离效果不佳；文献中常用流动相“磷酸二氢钾溶液-乙腈-甲醇体系”配备复杂，重现性较差；磷酸二氢钾溶液-乙腈体系下能够得到较满意的色谱峰。因此本研究最终采用乙腈-0.0125moL•L-1磷酸二氢钾缓冲液（8∶92，V/V）作为流动相。

通过研究还发现，应用磷酸二氢钾缓冲体系能够一定程度低改善峰形，但缓冲液浓度过大时会造成盐析，导致柱压升高，从而影响分离效果。本研究考察了0.0125moL•L-1磷酸二氢钾缓冲液pH值分别为4.5、3.6、3.2、3.0时万古霉素的保留时间及峰形变化。结果表明，当pH为3.2时，峰形对称，保留时间合适。因此流动相中磷酸二氢钾缓冲液的pH选择为3.2。

医学临床上，血浆样品的处理方面较为常用的有直接沉淀法和固相萃取法，这两种方法在万古霉素血浆样品的处理中均有应用[5][6]，本文采用直接沉淀法，以10%硫酸锌作为沉淀剂，使用剂量少，且处理效果较好，处理后样品对万古霉素色谱峰无干扰。