染料木素对人胃癌MGC—803细胞增殖及PKA活性的影响

韩银淑

[摘要] 目的 本文通过研究染料木素（Gen）对体外培养MGC-803细胞增殖以及PKA活性的影响，探讨Gen抑制MGC-803细胞系增殖的分子机制。方法 光镜下观察经Gen处理后人胃癌MGC-803细胞形态学改变；应用MTT法检测Gen对体外培养的人胃癌MGC-803细胞增殖影响；PepTag法检测Gen对MGC-803细胞PKA活性的调节。结果 与空白对照组比较，经Gen处理后MGC-803细胞外形呈不规则状、细胞间隙增大、折光性差；MTT实验发现Gen能够抑制体外培养的MGC-803细胞增殖，并且抑制作用呈现时间及浓度依赖性；浓度为40 μg/mL的 Gen可以显著上调MGC-803细胞的PKA活性（P<0.01）。结论 Gen对人胃癌细胞系MGC-803细胞的增殖有抑制作用，上调PKA活性可能是Gen抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的机制之一。

[关键词] 染料木素；MGC-803细胞；PKA活性

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）28-0001-03

染料木素（Genistein，Gen）是一种来源于大豆或其他豆科植物的大豆异黄酮，其具有类雌激素、抗氧化、调节血脂等生物活性。流行病学研究和实验研究证实Gen能降低乳腺癌[1]、前列腺癌[2]等激素依赖型肿瘤的发生率，对激素依赖型肿瘤的预防和治疗有一定的疗效。此外，Gen对消化道肿瘤也有明显的抑制作用，然而其抗肿瘤作用机制尚不清楚[3]。本文通过研究Gen对人胃癌细胞MGC-803增殖及PKA活性的影响，探讨Gen抑制MGC-803细胞系增殖的分子机制，为Gen在临床上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1细胞系

人胃黏液性腺癌细胞株MGC-803由齐齐哈尔医学院中心实验室赠予。培养基选用RPMI-1640完全培养液，加10%灭活hyclon胎牛血清、100 IU/mL链霉素和100 IU/mL青霉素。收集MGC-803细胞，稀释至1×105/mL，接种于培养皿，37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。当MGC-803细胞生长覆盖了80%培养皿表面积时要传代，实验时取生长状态良好的对数生长期细胞。

1.2 药物与试剂

RPMI-1640培养基为Invitrogen产品；胎牛血清为Hyclon产品；Aprotinine、PMSF、DTT、EGTA为Sigma-Aldrich产品；PKA活性检测试剂盒为Promega产品。Gen为陕西天行健生物化学技术有限公司产品，用1 mL MSO溶解配成浓度为40 mg/mL原液，4℃冰箱保存。实验时用培养液将Gen溶液稀释到所需要的浓度。

1.3主要实验仪器

Milli-Q超纯水系统为MILLIPORE产品；CO2培养箱为NuAire生产；电泳槽为BIO-RAD；CKX31型倒置显微镜为日本Olympus；IF-90紫外透射仪为上海顾林电光仪器厂生产。

1.4 实验方法

1.4.1 Gen对MGC-803细胞增殖的影响 实验设空白组（完全培养基）、空白对照组和Gen处理组。将对数生长期MGC-803细胞收集、离心并去除上清液，稀释MGC-803细胞至5×104个/mL。按每孔200 μL将MGC-803细胞接种于3块96孔培养板，37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养24 h。然后弃除培养液，Gen处理组分别加入用RPMI-1640培养液稀释的不同浓度Gen溶液200 μL/孔（Gen浓度分别为2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL）， 空白对照组则加RPMI-1640培养液200 μL/孔，空白对照组和Gen处理组均设3个平行孔。在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下分别培养24 h、48 h和72 h，各组均在实验终止前4 h时加5 mg/mL浓度的MTT 20 μL/孔，并于4 h后弃除上清液，每孔再加DMSO 150 μL。以空白组（完全培养基）将酶标仪调零，570 nm波长下测定OD值，计算Gen对GMC-803细胞增殖的抑制率。细胞增殖抑制率=（1-Gen处理组平均OD值/空白对照组平均OD值）×100%，实验结果重复3次。

1.4.2 Gen对MGC-803细胞形态学影响 实验设空白对照组和Gen处理组。上述两组均培养24 h后移除培养液，空白对照组加200 μL/孔的RPMI-1640培养液，Gen处理组每孔加40 μg/mL Gen溶液200 μL，各组均设平行孔3个。37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养24 h后，光镜下观察经Gen处理后MGC-803细胞形态学的改变。

1.4.3 Gen对MGC-803细胞PKA活性的调节 收集对数生长期的MGC-803细胞，稀释至5×104个/mL，接种于培养皿，并随机分为空白对照组、40 μg/mL Gen处理组。空白对照组加200 μL/孔的RPMI-1640培养液，40 μg/mL Gen处理组每孔加40 μg/mL Gen溶液200 μL，各组均设平行孔3个，37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养48 h。按试剂盒说明分别进行样品提取、考马斯亮蓝法测定蛋白、分离磷酸化和非磷酸化的PepTag短肽、荧光光度计定量分析检测PepTag结果及计算各组的PKA活性。

1.5 统计学方法

实验数据用SPSS13.0进行统计学处理，所有数据经正态性检验均服从正态分布。统计描述以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析比较多组间均数，进一步的两两比较则分别采用SNK法和Dunnet-t检验。两组间采用配对t检验，P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Gen对MGC-803细胞增殖的影响

MTT实验发现Gen对体外培养的MGC-803细胞增殖有抑制作用，且抑制作用呈时间及浓度依赖性。用Gen处理24 h后，10 μg/mL Gen组、20 μg/mL Gen组、40 μg/mL Gen组与空白对照组比较，对MGC-803细胞的抑制作用显著（P<0.01）；Gen处理48h后，5 μg/mL组、10 μg/mL组、20 μg/mL组、40 μg/mL组对MGC-803细胞的抑制作用显著（P<0.01）；而处理72 h后，所有Gen处理组均对MGC-803细胞有显著抑制作用（P<0.01）。Gen处理48 h和72 h与24 h比较，Gen浓度为10 μg/mL组、20 μg/mL组、40 μg/mL组与空白对照组比较有抑制作用（P<0.05），而对于2.5 μg/mL组，仅处理72 h时有抑制作用（P<0.05）。Gen处理72 h与48 h相比较，Gen浓度为10 μg/mL组、20 μg/mL组、40 μg/mL组抑制作用有统计学意义（P<0.05）。在Gen浓度为40 μg/mL时，处理72 h后对MGC-803抑制率达72.3%，见表1。

2.2 Gen对MGC-803细胞形态的影响

光镜下可见空白对照组MGC-803细胞生长状态良好，贴壁生长旺盛。细胞外形轮廓清晰、细胞间结构紧密、大小均匀，呈现多边形或梭形，且细胞质的折光性较强。而经过Gen处理后，发现MGC-803细胞生长状态较差，细胞外形呈现圆形或不规则状、细胞间隙明显增大，且细胞质折光性较差，见图1 。

2.3 Gen对MGC-803细胞PKA活性的调节

采用浓度为40 μg/mL的Gen处理MGC-803细胞，培养48h后检测PKA活性。实验结果显示，空白对照组PKA活性为（0.571±0.053） U/mL，而Gen处理组PKA的活性为（0.97±0.09） U/mL，两组间差异显著，有统计学意义（P<0.01），如图2。

3 讨论

Gen是一种来源于大豆以及其他豆科植物中的大豆异黄酮，其具有雌激素、抗氧化、调血脂等功能。流行病学调查表明，在经常食用豆制品的日本乳腺癌发病率仅为美国的1/4[4]，Gen可以降低乳腺癌[1]、前列腺癌[2]等激素依赖型肿瘤的发生率。有研究[3，5]亦发现，Gen可以抑制子宫内膜腺癌细胞（JEC）、人肝癌SMMC-7721、人胃癌SGC-7901细胞的增殖有明显的抑制作用，然而Gen抗肿瘤作用分子机制尚不十分清楚[3]。本文研究发现，与空白对照组相比较，光镜下经Gen处理的MGC-803细胞折光性差，细胞间隙增大，提示Gen对体外培养的MGC-803细胞具有细胞毒作用；而MTT实验结果验证Gen可以显著地抑制MGC-803细胞增殖，并随着作用时间和浓度的增加而增强，呈时间及浓度依赖性。

cAMP-PKA信号通路介导一系列的神经递质、激素等胞外信号进入细胞内，激活此通路可抑制细胞增殖，诱导分化[4-10]。PKA通过磷酸化激活下游转录因子，调节靶基因的转录。如PKA可催化CREB（cAMP-responsive element binding Protein，CREB）、CREM（cAMP-responsive element binding modulator，CREM）及ATF1（activating transcription factor 1，ATF1）磷酸化，被激活的转录因子与CBP（CREB binding protein）和p300结合调控下游靶基因[8，11]。实验研究已发现Gen可以激活SHZ-88大鼠乳腺癌细胞内cAMP-PKA信号通路，经浓度为15μg/mL的Gen处理5min和10min后，肿瘤细胞内cAMP浓度升高了11.0%和40.3%[9]。本文研究显示，浓度为40μg/mL的Gen作用MGC-803细胞48h后，可以显著提高MGC-803细胞的PKA活性。实验结果提示Gen亦可以不经过第二信使cAMP而直接激活PKA，进而抑制体外培养的MGC-803细胞增殖。综上所述，Gen能够抑制体外培养的人胃癌MGC-803细胞系的增殖，上调PKA活性可能是Gen抑制MGC-803细胞增殖机制之一。

[参考文献]

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[2] Pavese JM，Krishna SN，Bergan RC. Genistein inhibits human prostate cancer cell detachment，invasion，and metastasis [J]. Am J Clin，2014，28；100（1）：431-436.

[3] Yan GR，Zou FY，Dang BL，et al. Genistein-induced mitotic arrest of gastric cancer cells by downregulating KIF20A：a proteomics study[J]. Proteomics，2012，12（14）：2391-2399.

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（收稿日期：2014-05-05）

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（收稿日期：2014-05-05）