以抑菌活性为指标优化清喉口含片浸膏的提取工艺

常 翠，杨宏图，赵 奎，郑杭生，陈思思

(1.深圳市人民医院暨南大学第二临床医学院药学部，广东深圳 518020;2.浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053)

急性咽炎多由细菌、病毒感染所致，细菌感染多由溶血性链球菌引起，其次为流感嗜血杆菌、肺炎球菌、葡萄球菌等［1］。其临床表现为突然发作的咽痛、扁桃体发黄、渗血及颈部肿大等，严重时有发热、头痛、全身不适等症状［2］。运用中医药治疗该病，具有疗效好，副作用小且剂型多样，适应临床需要的特点［3-4］。中医药治疗急性咽炎的剂型主要包括口含片、汤剂、颗粒剂、丸剂、合剂等［5］。清喉口含片［6-7］由岗梅根、板蓝根、甘草等中药组成，是在临床应用多年的医院制剂。清喉口含片具有凉血利咽，清热解毒，消炎消肿作用，临床主要用于咽喉肿痛、风热症急性咽炎，经多年应用，疗效确切，未见明显不良反应。口含片可以局部发挥作用，提高局部疗效。以药效为评价指标优化中药材提取工艺已在实践中逐步推广［8-12］，该方法使中药提取产物突出其某方面疗效，能反映中药中多成分的综合作用，为中药提取工艺的优化提供了一种新的思路。本实验按中医药理论和临床对治疗作用的要求，以琼脂扩散法测得乙型溶血性链球菌的抑菌圈直径为评价指标，采用均匀设计法优化清喉口含片浸膏的水提醇沉工艺，并以最低抑菌质量浓度 (MIC)、最低杀菌质量浓度 (MBC)评价清喉口含片浸膏的抑菌作用。

1 药品与仪器

药材均购于深圳市药材公司，经本院中药库鉴定为正品。BZY150K型自动煎药机 (天津三延精密机械有限公司);比重计 (沈阳玻璃计器厂);抗生素药敏纸片 (中国药品生物制品检定所);微量加样器 (上海求精生化仪器有限公司)。

绿脓杆菌 ATCCT 27853、金黄色葡萄球菌 ATCCT 25923(中国食品药品检定研究院)，乙型溶血性链球菌、甲型溶血性链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌 (深圳市人民医院检验医学部临床收集、鉴定并提供)。水解酪蛋白肉汤 (MHB)(批号20120310，规格250 g，杭州天和微生物试剂有限公司提供，临用时配制，121℃、15 min灭菌)。流感嗜血杆菌实验时加X、V因子，链球菌实验时加5%溶解的羊血。营养肉汤 (批号120213，中国食品药品检定研究院提供，按说明书配制)。

2 方法与结果

2.1 拟定提取工艺 根据前期研究结果［6］与片剂服用量限制的要求，暂拟定如下水提醇沉的工艺路线及部分参数:按清喉口含片的处方组成比例，岗梅根-板蓝根-蒲公英-甘草 (5∶5∶5∶1)，共取1920 g生药，每次加6倍量水，按规定的提取时间、提取次数煎煮提取后，滤过，合并滤液，滤液浓缩至与生药量之比为1∶1(mL∶g)，加乙醇使达到一定的含醇量，于25℃下静置24 h，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.2，即得浸膏，该浸膏用作清喉口含片的主药及用于药效学实验。

2.2 抑菌圈直径的测定［13-14］采用琼脂扩散法测定抑菌圈直径。取浓度为1.5×108CFU/mL的标准菌 (乙型溶血性链球菌)，均匀涂布于培养基上，打孔，取50 μL质量浓度为50 mg/mL的浸膏，加入孔中。以等体积灭菌注射用水作为对照。再将培养皿置于35℃恒温箱中，培养24 h后，用卡尺测量抑菌圈的直径。

2.3 提取工艺条件的优化

2.3.1 试验方法 根据前期试验结果［6］，选取提取时间、提取次数及醇沉体积分数3个影响因素，通过均匀设计法优选最佳提取工艺条件。均匀设计试验选用U7(76)表，根据其使用表规则，选取第1、2、3列构成U7(73)表。以拟水平法安排提取次数的水平，因为中药提取一般不超过3次，故将原表中的1、2水平归为1次，3、4水平归为2次，5、6、7水平归为3次。同时，为了避免两个高档次水平相遇，对提取时间的水平进行了调整。因素及其水平安排详见表1。分别按照“2.1”项下的拟定提取工艺方法完成表1中的各号试验，制得浸膏，再分别按“2.2”项下的方法测量乙型溶血性链球菌的抑菌圈直径，作为浸膏抑菌活性的评价指标，实验结果列于表1。

表1 均匀设计试验因素及其水平与结果

2.3.2 结果分析 用沈阳药科大学开发的均匀设计回归分析及优化系统 (UROS)处理试验数据，引入或剔除自变量的F临界值设定为0.1，可得如下回归方程:

复相关系数R=0.9993，Q=0.6549，F=338.2297，查F检验临界值表得=99.2，故 F ＞，F 检验通过，说明回归方程具有显著意义，置信度达99%以上。通过回归方程可以看出提取次数对抑菌圈直径的影响为非线性，且与提取时间和醇沉体积分数均存在交互作用。按抑菌圈直径最大得到优选条件:每次煎煮60.1 min，提取3次，醇沉体积分数40.2%，预测抑菌圈直径为40.6 mm，区间估计为 (38.891 mm，42.294 mm)，优于以上所有实验结果。

2.3.3 结果验证 按照处方组成比例，共取1920 g生药，按照“2.1”项下的提取工艺方法，结合优化得到的最佳条件进行提取试验，重复3次，所得浸膏取一部分水浴蒸干，105℃干燥3 h，计算出膏率为 (8.65±0.29)%。剩余浸膏分别按“2.2”项下测定抑菌圈直径，测得结果为(40.5±0.7)mm，与预测结果一致，故优化结果可信。

2.4 体外抑菌试验［7］

2.4.1 MIC测定 以标准试管二倍稀释法测定MIC，将清喉口含片浸膏 (相当于1 g生药/mL)用营养肉汤按二倍稀释法配制成系列浓度稀释液。将各试验液分别置于玻璃试管中 (1.0 mL/管)，每一支管加入1.0 mL新鲜菌液(1.5×106CFU/mL)，混匀，均行双管法试验，在生化培养箱中于 (35±1)℃培养24 h，观察细菌生长情况。上层液浑浊 (或有溶血者)为有菌生长，上层液澄清 (或血球沉降、无溶血者)为无菌生长，肉眼看不到细菌生长对应的药液最低质量浓度为MIC。同时做空白样品对照、空白对照、空白菌株对照。

2.4.2 MBC测定 采用肉汤对倍稀释平板活菌计数法，即用测定MIC的无细菌生长的培养基，将各管培养基用0.01 mL定量接种环接种于相应的培养基平皿上，在生化培养箱中于 (35±1)℃培养24 h，此后观察细菌生长情况，培养基平皿上无细菌生长的平板对应的药液最低质量浓度为MBC。

2.4.3 实验结果 实验用各菌株生长良好，各空白管、空白样品对照管均未见细菌生长。清喉口含片、双黄连口服液 (阳性对照药)对大多与急性咽喉炎有关的细菌均有比较显著的抑制和杀灭作用，特别是对乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、甲型溶血性链球菌和流感嗜血杆菌，其MIC为0.0312～0.125 g(生药)/mL，MBC为0.125～0.5 g(生药)/mL，结果详见表2。

表2 清喉口含片体外抑菌试验结果

3 结论与讨论

本实验以抑菌活性为指标所得优化工艺与本课题组前期以出膏率、损失率为指标的优化工艺［6］对比，提取次数、时间基本一致，醇沉后的出膏率在合理范围内，但是醇沉体积分数降低近20%，故工艺更具经济性;且以抑菌活性为指标，所得的优化结果更合理、更有针对性。清喉口含片浸膏的体外抑菌实验结果显示其抑菌率也有显著提高，与前期本课题组其他提取工艺所得浸膏的抑菌试验结果［7］对比，对于阳性菌，MIC、MBC一般提高一倍，对于阴性菌大多数都提高了3倍;与阳性对照药双黄连口服液相比，清喉口含片对于金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的MIC和MBC值均比双黄连口服液低，说明有较优的抑菌、杀菌作用，且提示本品可能在治疗阴性菌引起的牙痛方面有应用价值，可以进行进一步的研究。

从均匀设计回归方程的各项对比可见，B、C项的系数占比重较大，说明提取次数与醇沉浓度具有较大交互作用。

本制剂采用水提醇沉工艺能保留有效成分，又可除去杂质。本实验采用均匀设计并对因素、水平进行调整尽量避免各因素在高水平重合，实验数据经回归处理，得回归方程，结合实践经验选择优化条件，结果确切，建议在中药提取研究中推广使用。

本实验优化工艺所得浸膏将作为清喉口含片的主药与蔗糖粉 (50%)、甘露醇 (20%)、乳糖 (30%)等辅料混合，再加上冰片、薄荷制成口含片。清喉口含片在咽喉局部的停留时间较长，局部浓度高，可以达到局部给药、提高疗效的作用。

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