白藜芦醇对酪氨酸酶活性抑制作用的实验研究①

2014-11-02罗利琼

宜春学院学报 2014年6期

罗利琼

(广东药学院生命科学与生物制药学院，广东广州 510006)

白藜芦醇 (Resveratrol)是多酚类化合物，主要来源于葡萄 (红葡萄酒)等多种植物的果实，［1－3］有众多的研究表明，白藜芦醇对心脑血管系统、免疫系统、皮肤及其骨质疏松等均有较强的生物活性。［4－6］近年来也有一些研究认为，白藜芦醇具有对抗黑色素的作用，其作用的主要机制为抑制酪氨酸酶 (Tyrosinase，TYR) 的生物活性。［4，7］酪氨酸酶抑制剂包括白藜芦醇的研究报道较多，［8，9］其作用主要是减少人体皮肤黑色素的合成，从而达到美白、治疗黄褐斑、雀斑的作用，因此，白藜芦醇可用作化妆品的添加剂。［7，8］

酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶，人体表皮色素的深浅以及色素沉着疾病等均与酪氨酸酶的表达和在体内的活性相关。［7］在药品和食品方面，针对白藜芦醇的研究较多，［2，4－6，10］而在化妆品中的应用研究相对较少，因此国内外许多研究者均致力于从天然中草药中提取有效抑制黑色素的成分。［7，11］鉴于上述理由，论文主要研究雪梨中提取的酪氨酸酶，在体外实验的条件下，温度与白藜芦醇浓度的变化对酪氨酸酶抑制效果的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

1)高速台式冷冻离心机，型号:TGL－16，制造厂家:金坛市城东新瑞仪器厂;2)紫外可见分光光度计，型号:UV－4501S，制造厂家:天津市港东科技发展有限公司;3)组织捣碎匀浆机，型号:JJ－2，制造厂家:常州国华电器有限公司;4)磁力搅拌器，型号:ZNCL－BS，制造厂家:上海一科仪器有限公司;5)电子分析天平，制造厂家:厦门精艺兴业科技有限公司;循环水真空泵，型号:SHZ－Ⅲ，制造厂家:上海亚荣生化仪器厂;数显恒温水浴锅，型号:HH－4，制造厂家:常州国华电器有限公司。

1.2 主要试剂

1)新鲜雪梨从市场上购得。2)95%白藜芦醇，湖北巨胜科技有限公司，CAS号:501－36－0，规格:HPLC 95%，分子式:C14H12O3，分子量:228.24。3)60%乙醇、邻苯二酚、丙酮、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠均为国产分析纯。

1.3 溶液的配制

1)磷酸氢二钠和磷酸二氢钠按比例配制pH6.8的磷酸缓冲溶液。

2)精确称取1.100g邻苯二酚溶于1000mL磷酸缓冲液中，配制成10mmol/L的邻苯二酚溶液，再稀释成所需浓度的溶液。

3)白藜芦醇溶液的配制精确称取0.0228g 95%的白藜芦醇溶于10mL 60%的乙醇中，配制成10mmol/L的白藜芦醇溶液，再稀释成所需浓度的溶液。

1.4 酪氨酸酶的提取

1)取新鲜雪梨果肉组织150g加入－20℃的冰丙酮300mL，用高速组织捣碎机匀浆5min，0℃条件下抽滤，用冰丙酮反复冲洗残渣，吸滤至白色粉末即为丙酮粉，－20℃保存备用。2)取丙酮粉3g加入pH值6.8的磷酸缓冲液60mL，0℃条件用磁力搅拌器匀浆15min。3)调节冰冻高速离心机温度至－2℃、转速12000rpm，离心30min后取上清液，得酪氨酸酶提取液。［2，3］

2 结果

2.1 酪氨酸酶的吸收波长与活性

图1 酪氨酸酶的吸收图谱

酪氨酸酶活力的测定方法参照文献［12，13］稍加修改进行。取1mmol/L邻苯二酚溶液2.9mL加入比色杯中，再加入酪氨酸酶提取液0.1mL，30℃水浴3min;对照则加水0.1mL;在波长350～600nm范围内测其吸光度 (A)，确定以邻苯二酚为底物的酪氨酸酶产物的最大吸收波长为412nm，详细见图1。

2.2 温度对酪氨酸酶活性的影响

不适宜的温度会破坏酶活性部位三维结构的完整性，而它又是保持酶活力的关键，因此温度是影响酶活性的一个重要因素。［11］

分别取1mmol/L邻苯二酚2.9mL加入8个比色杯中，将数显恒温水浴锅温度分别设置10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃ 和 45℃，预浴后加0.1mL酪氨酸酶提取液，对照0.1mL蒸馏水，立刻混匀，在恒温下测定波长为412nm的吸光度值随时间的增长值，从直线斜率求得酪氨酸酶活力，作温度与酶活力关系图。图2显示，随着温度的升高，酪氨酸酶的活性不断提高，30℃达到最佳活性后，酪氨酸酶的活性又逐渐降低。当温度达到50℃，可近似地认为酪氨酸酶已没有活性，即酪氨酸酶失活。因此调节温度能有效地改变酪氨酸酶的活性。

酪氨酸酶活力计算方法:酪氨酸酶的相对活性=时间扫描图中每条直线的斜率。

图2 温度的变化对酪氨酸酶活性的影响

3.3 白藜芦醇浓度对酪氨酸酶活性的影响

分别取1mmol/L邻苯二酚2.8mL加入5个比色杯中，30℃恒温水浴后加0.1mL酪氨酸酶提取液，再分别加入0.1mL不同浓度 (分别为1.25、2.5、5、8、10mmol/L)的抑制剂白藜芦醇，立刻混匀，将紫外可见分光光度计波长调为412nm，在恒温下测定吸光度值随时间的增长值，从直线斜率求得酶活力。以不加效应物为对照，测定酶的相对剩余活力，结果表明白藜芦醇对酪氨酸酶有显著的抑制作用，随着效应物浓度的增大，酶活力下降(见图3)。白藜芦醇浓度在0－10mmol/L之间，抑制率上升较快，酶活力下降较为显著，其半数抑制率IC50为5.3mmol/L(见图4)。

相对酶活力 (%)=(A1－A0)/A1×100%，式中A1为含有底物、酶时测活体系的吸光度值，A0为含有底物、酶、白藜芦醇时测活体系的吸光度值。

图3 不同浓度白藜芦醇与酪氨酸酶吸光度的变化

图4 白藜芦醇浓度与酪氨酸酶活性抑制率的关系

3 讨论

白藜芦醇是一种来源于植物的天然提取物，无毒无害，其生物学作用众多，主要表现在抑制酪氨酸酶活性从而具有增白美白效应，同时还具有抗氧化、抗自由基、抗炎、抗菌、抗血栓、减肥等效应。［4－8］

本研究通过实验方法，确定了以邻苯二酚为底物的酪氨酸酶产物的最大吸收波长为412nm，将紫外可见分光光度计波长调为412nm，测定的吸光度值随时间的增长值，通过图2中的直线斜率得到酪氨酸酶的相对活性，当温度为30℃时酪氨酸酶的活性最大。在上述确定的最佳条件下，白藜芦醇对酪氨酸酶有显著的抑制作用，随着效应物即白藜芦醇浓度的增大，酪氨酸酶的活力逐渐下降，其半数抑制率IC50为5.3mmol/L。研究结果表明，在实验室条件下，白藜芦醇有较强的抑制酪氨酸酶的作用，至少理论上可以表明白藜芦醇可以考虑应用于化妆品，以增加化妆品的美白效应。

上述研究结果与其他研究类似，包括其热稳定性，白藜芦醇对酪氨酸酶的抑制作用和白藜芦醇的分离等等。［3，14，15］本研究方法操作简单易行，便于快速提取植物中的酪氨酸酶，测定白藜芦醇对酪氨酸酶的抑制作用时，设备、试剂与条件相对易得，可以用此方法快速筛选许多植物中酪氨酸酶，并通过新的设计方案测定植物中酪氨酸酶活性的大小或含量。其缺点是，从新鲜雪梨中得到的酪氨酸酶提取液中的酪氨酸酶含量，利用此方法并不能确定，因此，得到的结果也只能是相对的。

毫无疑问白藜芦醇具有众多的药用价值，除此之外还可以用作食品添加剂和美容化妆品的添加剂，［16］由于其具有较强的抑制酪氨酸酶的作用，理论上具有美白作用，但是，作为化妆品中的添加剂，白藜芦醇是否可以通过皮肤吸收、吸收的速度及其在什么条件下吸收效率最佳等等，这些问题仍然值得进行研究。

［1］李婷，李胜，张青松，等.葡萄不同组织部位白藜芦醇含量的比较［J］.甘肃农业大学学报，2009，44(2):64 －67

［2］郑湘娟，余淑娴，徐晓芳，等.紫外分光光度法测定虎杖中白藜芦醇的含量［J］.时珍国医国药，2008，19(8):1881－1882

［3］佟志远，颜新培，李顺祥，等.桑枝中氧化白藜芦醇的分离与鉴定［J］.蚕业科学，2011，(5):948－951

［4］郑晓英，朱深银.白藜芦醇血管保护作用的研究进展［J］. 中国药房，2013，25(11):1053－1056

［5］张叶青，谢一辉，黄丽萍.白粉藤属植物化学成分及生理活性的研究进展［J］.时珍国医国药，2006，16(1):107－108

［6］郭刚，赵海燕，宋吉锐.白藜芦醇对离心运动后骨骼肌微损伤的修复［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13(24):4677 －4681

［7］陈清西，宋康康.酪氨酸酶的研究进展［J］.厦门大学学报(自然科学版)，2006，45(5):731 －737

［8］刘晓丹，黄璜，陈清西.苯甲酸对蘑菇酪氨酸酶抑制作用机理的研究［J］.厦门大学学报(自然科学版)，2003，42(1):102－106

［9］林敏，邱凌，周盛梅，等.4－卤代苯甲酸对马铃薯多酚氧化酶的抑制效应［J］.食品科学，2008，29(5):56－59

［10］陆珊，胡源，刘鑫，等.曲酸对马铃薯酪氨酸酶的抑制作用研究［J］.化学研究与应用，2005，17(6):729－732

［11］CHEN QX，KUBO I.Kinetics of mushroom tyrosinase inhibition by Quercetin［J］.J Agric Food Chem，2002，50(14):4108－4112