Corning® hybrigro SF™培养基对提高杂交瘤细胞培养密度和抗体产量的研究

2014-10-31HilaryShermanMarkRothenberg

中国医药生物技术 2014年4期

Hilary Sherman，Mark E. Rothenberg

Corning®hybrigro SF™培养基对提高杂交瘤细胞培养密度和抗体产量的研究

Hilary Sherman，Mark E. Rothenberg

200040 上海，康宁生命科学亚洲技术中心

近几年，抗体作为生物类治疗药物的需求显著增长。因此，提高抗体生产效率并且降低生产成本愈发必要。而康宁 hybrigro SF™培养基的开发，正是致力于在不使用昂贵血清的情况下仍能够高效培养杂交瘤细胞，提高抗体产量。我们使用两种不同的杂交瘤细胞株，并通过与两种商业化生产的无血清培养基以及一种被广泛使用的含血清培养基对比，验证 hybrigro SF™培养基在高密度杂交瘤细胞培养及蛋白产量方面的优越性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂及耗材 AE1 购自ATCC；10% 胎牛血清（FBS）、DMEM 培养基均为康宁公司产品；IgG2a ELISA protocol 试剂盒购自美国ADI 公司；Easy titer IgG 分析鉴定试剂盒为美国Thermo 公司产品。

1.1.2 仪器 BioProfile®Flex 分析仪购自美国 Nova Biomedical 公司。

1.2 方法

MH677（专利杂交瘤细胞株）及 AE1 细胞株使用康宁 hybrigro SF™培养基、两种无血清培养基以及含有 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基培养，并用 BioProfile®Flex 分析仪进行分析。将细胞以 50000 个/ml 的密度接种至 125 ml 的锥形瓶中，并将锥形瓶置于恒温恒湿培养箱中（5% CO2，37 ℃）以 90 r/min 转速培养 4 d。每天定时取样培养基对细胞活力、细胞营养及细胞代谢产物进行分析。同时，每天取样培养基，使用 IgG2a ELISA protocol 试剂盒（针对 MH677 细胞）或 Easy titer IgG 分析鉴定试剂盒对两种细胞的蛋白产量（小鼠 lgG2a）进行评估。

1.2.1 细胞复苏待冻存管中大部分的冰融化后，迅速将冻存管中内容物转移，将细胞以 4 × 105~ 5 × 105个/ml 的密度接种于新鲜的无血清培养基中。因细胞在冷冻过后十分脆弱，如果使用离心机进行操作，注意使用低速离心。观察细胞生长和活力，并重新开始常规细胞维持操作。

1.2.2 直接适应

⑴在初代培养中，细胞接种密度建议为常规细胞接种密度的 2 倍。

⑵当细胞密度达到 2 × 106~ 3 × 106个/ml 时，进行传代培养。

⑶在 2 ~ 4 代的细胞传代培养过程中，将活细胞以 2 × 105个/ml 的接种密度接种于新鲜的无血清培养基中，进行传代培养。

1.2.3 连续适应

通过 2 ~ 3 代的细胞培养逐步改变培养基成分：初代培养中将两种培养基以 50:50 比例制成混合培养基，第一次传代培养中将 hybrigro SF™培养基比例提高至 75%，以 25:75 比例制成新的混合培养基。细胞接种密度约为 5 × 105个/ml。

为了维持hybrigro SF™培养基中细胞的最佳生长和生产力状态，每 3 ~ 4 天，当细胞密度达到 1 × 105~ 2 ×105个/ml 时，应传代培养至新鲜的无血清培养基中。

1.2.4 低温储存

⑴轻柔离心处于对数生长期的细胞制备细胞团用于冻存。去除上清并将细胞团重悬细胞冻存液中（如，500 μl 条件培养基：500 μl 新鲜培养基+ 50 ~ 100 μl DMSO），使得细胞最终密度为 5 × 106个/ml。

⑵将细胞悬液分装至冷冻管，根据标准操作流程进行冷冻。

1.3 统计学处理

单因素 ANOVA：两两比较检验：一旦确定均值间存在差值，两两范围检验和成对多重比较就可以确定哪些均值存在差值。范围检验识别彼此间没有差值的同类均值子集。成对多重比较检验每一对均值之间的差分，并得出一个矩阵，其中星号指示在 0.05 的 α 水平上的组均值明显不同。

Bonferroni 使用检验在组均值之间执行成对比较，但通过将每次检验的错误率设置为实验性质的错误率除以检验总数来控制总体误差率。这样，根据进行多个比较的实情对观察的显著性水平进行调整。

Student-Newman-Keuls 使用学生化的范围分布在均值之间进行所有成对比较。还使用步进式过程比较具有相同样本大小的同类子集内的均值对。均值按从高到低排序，首先检验极端差分。

2 结果

2.1 MH677 细胞的生长及表现

MH677 细胞在康宁 hybrigro SF™培养基及两种无血清培养基中均实现细胞重组。相比于其他两种已实现商业化生产的无血清培养基，MH677 细胞在 hybrigro SF™培养基中的生长更加旺盛，具有更高的细胞密度。并于培养的第4 天显示出显著差异（图 1）。此外，相比于另外两种无血清培养基，hybrigro SF™培养基中的细胞具有更高的 lgG2a生产能力，且实验结果具有显著的统计学意义（图 2）。

细胞生长密度（× 106个/ml）2.0 1.5 1.0 0.5 0 1 2 3 4 时间（d）

lgG2a 产量（× 106 pg/细胞）2.0 1.5 1.0 0.5 0 hybrigro SF™ 对照组 1 对照组 2

2.2 AE1 细胞的生长及表现

AE1 细胞在康宁 hybrigro SF™培养基、两种无血清培养基以及含有 10% FBS 的 DMEM 培养基中均实现细胞重组。AE1 细胞在 hybrigro SF™培养基中的生长情况不仅优于已商业化生产的无血清培养基，在培养的第 4 天后，细胞密度甚至高于含血清的培养基的细胞密度，且实验结果具有显著的统计学意义（图 3）。此外，相比于其他无血清以及含血清培养基，hybrigro SF™培养基中的 AE1 细胞在第 4 天具有更高的总蛋白产量，且实验结果具有显著的统计学意义（图 4）。