抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测技术的建立

孙一帆，杨全利，黄建芳，赵凤芝，向军俭



抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测技术的建立

孙一帆，杨全利，黄建芳，赵凤芝，向军俭

510632 广州，广东省分子免疫与抗体工程重点实验室/暨南大学抗体工程研究中心

制备、筛选多株具有商用价值的可配对的高特异性、高亲和力的抗人甲胎蛋白（hAFP）单克隆抗体，初步建立双抗体夹心 ELISA 检测方法。

通过经典的淋巴细胞杂交瘤技术筛选分泌抗 hAFP 单抗的杂交瘤细胞株；对筛选所得单抗的特性进行鉴定分析；双抗体夹心 ELISA 法筛选最佳配对抗体；初步建立 DAS-ELISA 检测方法并检测血样，绘制其标准检测曲线并与进口试剂盒比较。

共获得 12 株稳定分泌抗 hAFP 单抗的杂交瘤细胞株，其中 Ab 1 ~ Ab 5 5 株单抗的腹水效价均高于 600 万，Ab 5 的效价高达 3000 万；特异性鉴定结果表明 Ab 1 ~ Ab 5 均能够特异识别天然 hAFP 分子，但 Ab 5 与人血清白蛋白（HSA）存在较强交叉反应；抗体配对实验共筛选出 5 对（Ab 1/HRP-Ab 2、Ab 1/HRP-Ab 4、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 3/HRP-Ab 4 和 Ab 4/HRP-Ab 1）能够满足 hAFP 检测要求且无交叉反应的配对抗体，最终确定 Ab 1 + Ab 3/ HRP-Ab 2 和 Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 4 为最佳配对组合；利用最佳配对抗体组合建立标准检测曲线，其线性检测范围为 5 ~ 250 ng/ml，最低检测限 2 ng/ml，检测上限 400 ng/ml，优于进口试剂盒的线性范围 5 ~ 200 ng/ml 和最低检测限 5 ng/ml；样检结果显示自制试剂盒的阳性血清检测准确率 99.2%（119/120 例），阴性血清准确率 100%（40/40 例）。

筛选获得的 4 株高亲和力、高特异性抗 hAFP 单抗均可应用于 DAS-ELISA 试剂盒的研制，Ab 1和 Ab 3 适合作为捕获抗体，Ab 2 和 Ab 4 适合作检测抗体；自制试剂盒的线性检测范围和最低检测限均优于进口试剂盒，表明具有商用价值。

甲胎蛋白类； 抗体，单克隆； 双抗体夹心ELISA

人甲胎蛋白（human alpha fetoprotein，hAFP）是一种由胎儿肝细胞和卵黄囊合成出的胚胎性糖蛋白，其功能与人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）相似，可视其为胎儿发育时期的 HSA替代物[1-2]。正常情况下，hAFP 仅存在于胎儿血清中，胎儿出生一年后 hAFP 浓度降回正常人水平（< 5 ng/ml），正常人血清中的浓度一般不高于20 ng/ml。当身体发生原发性肝癌时，肝癌细胞可大量分泌 hAFP 于外周血中，引发血液 hAFP 浓度的异常升高。

hAFP 是最早发现的肿瘤标志物之一，其长期以来被作为肝癌、胎儿缺陷以及胚胎相关癌的重要血清分子标记物，是血液检验中的重要评价指标分子[3-4]。除应用于产前诊断和肝细胞癌诊断外，hAFP 的血液检测对肝损伤、肝硬化、肝炎、肠胃癌、神经管损伤、内胚窦瘤、生殖系统癌症等疾病的诊断及病情监控也具有重要意义[5-6]。

中国是个人口大国，产前诊断与每个家庭都息息相关；同时，中国又是一个肝癌高发地区，每年死于肝癌的人数占全世界死亡人数的40% 以上[7]，由于中晚期肝癌基本无有效治疗方法，所以对原发性肝癌特异性肿瘤抗原 hAFP 血液浓度的全民普查和早期诊断是解决肝癌高死亡率的最有效措施[8]。因此，灵敏、特异、准确、简便、低成本的血清 hAFP 检测方法的建立迎合了社会的迫切需要。

本研究通过制备多株特异性、高亲和力的抗 hAFP 单克隆抗体，从中筛选出具有商用价值的配对抗体，为研制双抗体夹心 ELISA（DAS-ELISA）试剂盒奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

6 周龄 SPF 级雌性 BALB/c 小鼠购自南方医科大学动物中心；hAFP 和 HSA 购自美国Fitzgerald 公司；患者血清取自广州华侨医院；标准抗体（AFP-01、AFP-11）和进口 DAS-ELISA 试剂盒均购自英国ABCam 公司。

1.2 方法

1.2.1 抗 hAFP 单克隆抗体的制备 免疫BALB/c 小鼠，通过常规的细胞融合方法和有限稀释法克隆化，筛选能够稳定分泌抗 hAFP 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并制备其腹水型单抗。

1.2.2 单抗的特性鉴定 用间接 ELISA 法分别测定筛选所得单抗的 IgG 亚类、腹水效价及与HSA 的交叉反应。利用筛选所得的 5 株高亲和力单抗，对 HepG2 人肝癌细胞进行免疫荧光染色（FITC 和 DAPI 双染，400 倍显微镜下观察），以鉴定单抗与天然 hAFP 分子特异性结合的能力。

1.2.3 双抗体夹心法配对实验 HRP 标记单抗后，使用 DAS-ELISA 棋盘法筛选配对抗体对。以400 ng/ml 的 hAFP 作为检测原，4 mg/ml 的 HSA 作为交叉反应对照，PBS 作空白对照。

1.2.4 双抗体夹心 ELISA 法的建立 以 Ab 1 和 Ab 3 为捕获抗体，以 HRP-Ab 2 或 HRP-Ab 4为检测抗体，建立 DAS-ELISA 检测方法。经检测条件优化，绘制其标准检测曲线，并与进口试剂盒的标准曲线比较。

1.2.5 样品检测 使用已优化的自制双抗体夹心试剂盒（Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 2）检测血清样品，并与医院检测结果和 ABCam 双抗体夹心检测试剂盒的检测结果比较。

2 结果

2.1 单克隆抗体的制备与特性鉴定

共筛选得到 12 株能够稳定分泌抗 hAFP 单抗的杂交瘤细胞株，其特性鉴定结果如表 1 所示。Ab 1 ~ Ab 8 的单抗亚类均为IgG1 型，Ab 9 ~Ab 12 为 IgG2 型。Ab 1、Ab 2、Ab 3、Ab 5 均具有较高腹水效价且明显高于其他细胞株，其中Ab 5 的腹水效价最高，滴度为 1:3 × 107，Ab 1~ Ab 3 的腹水滴度为 1:6.5 × 106~ 1:9 × 106；Ab 4 的细胞株不能产生腹水，但其细胞上清也具有较高效价，滴度达 1:16 000。通过间接 ELISA 测定单抗与高浓度交叉反应原 HSA 的交叉反应性，发现 Ab 2、Ab 3、Ab 4、Ab 10 和 Ab 12 具有很好的 hAFP 特异性，无交叉反应；Ab 1 和 Ab 6 在效价稀释倍数时与 HSA 有轻微交叉反应，Ab 5、Ab 7、Ab 8 和 Ab 9 的交叉反应较强。

结果表明，Ab 1 ~ Ab 4 这 4 株单抗具有亲和力高、特异性好的特性，Ab 5 的特异性较差，但效价极高，提示其可能具有极高亲和力。

2.2 单抗特异性鉴定

为验证筛选所得单抗是否能够与天然存在的 hAFP 分子特异性结合，使用 Ab 1 ~ Ab 5 这 5 株高亲和力单抗进行了 HepG2 人肝癌细胞免疫荧光染色，无关单抗作阴性对照组。结果显示，在 5 株单抗对应的实验组中，HepG2 细胞内均呈现明显绿色荧光，而无关抗体对照组细胞未观察到绿色荧光，说明 Ab 1 ~ Ab 5 单抗特异性识别了人肝癌细胞胞浆内的 hAFP 分子，证明该 5 株单抗均能够特异识别天然产生的人源 AFP 分子（图 1）。

表 1 单抗的特性鉴定

注：“–”表示与HSA 无交叉反应；“+”表示与HSA 有交叉反应，“+”数量越多表示交叉反应越强。

Notes: “-”indicates no cross-reaction with HSA; “+” indicates a cross-reaction with HSA, more “+” indicates stronger cross reaction.

图 1 HepG2 细胞的免疫荧光染色（400 ×）

Figure 1 Immunofluorescence staining of the HepG2 cells

2.3 DAS-ELISA 棋盘法配对实验

纯化并用 HRP 标记 7 株亲和力较高的单抗（Ab 1、Ab 2、Ab 3、Ab 4、Ab 5、Ab 6、Ab 10），以用于抗体配对实验。配对结果显示（表 2），在 49（7 × 7）种抗体配对组合中，有 13 种组合可形成双抗体夹心配对，其中，与 HSA 完全无交叉反应且具有较好配对效果的共有 5 种组合：Ab 1/ HRP-Ab 2、Ab 1/HRP-Ab 4、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 3/ HRP-Ab 4和 Ab 4/HRP-Ab 1。

表 2 双抗体夹心法筛选配对抗体

注：“+”数量代表450值的高低：“+”> 1.0，“++”> 2.0，“+++”> 3.0；“–”代表450值< 0.5；红色“+”代表无交叉反应，“+*”代表有或略有交叉。

Notes: The quantity of “+” indicates the valve of450: “+” > 1.0, “++” > 2.0, “+++” > 3.0; “–”< 0.5; The red “+” indicates no cross-reaction, “+*” indicates a cross-reaction with HSA was observed.

2.4 DAS-ELISA 检测方法的建立及比较

通过一系列检测方法优化，最终确定以 Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 2 和 Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 4 为最佳配对组合建立 DAS-ELISA 检测方法，两组配对组合的检测范围及灵敏度相同，建立其标准检测曲线，并与进口试剂盒的标准曲线比较。

结果显示，自制 DAS-ELISA 检测方法与进口试剂盒的完整检测曲线非常相近，检测范围和检测灵敏度大致相同；但自制 DAS-ELISA 检测方法在 hAFP 浓度 0 ~ 300 ng/ml 范围内的线性检测曲线优于进口试剂盒，进口试剂盒的线性标准曲线顶部弯曲程度较大（图 2）。

虽然进口试剂盒说明书中指出该试剂盒的线性检测范围为 2 ~ 300 ng/ml，但实际测得的线性范围只有 5 ~ 200 ng/ml，检测下限 5 ng/ml；而自建检测方法的线性检测范围为 5 ~ 250 ng/ml，检测下限 2 ng/ml，检测上限 400 ng/ml，略优于进口产品。

2.5 样品检测

共收集了 hAFP 阳性患者血清 120 例（孕妇118 例，原发性肝癌 2 例），阴性正常人血清40 例，分别用自建的 DAS-ELISA 检测方法和进口试剂盒检测血样，并统计样检准确率。结果显示，两试剂盒均能有效检测人血清中 AFP 的浓度。其中，进口试剂盒对阴、阳性血清样品的检测准确率均为100%，检测稳定、准确；自建的检测方法在对120 份阳性血清检测时检出 1 例阴性，准确率 99.2%，在对 40 份阴性血清检测时，准确率 100%，同样得出较准确结果（表 3）。证明该初步建立的 DAS-ELISA 试剂盒检测方法能够应用于实际血清样品的检测。

OD4503.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 OD4503.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 1 10 100 1000 100 200 300 400 自制 AFP 标准溶液（ng/ml）Self-made standard AFP solutions（ng/ml）A 试剂盒 AFP 标准溶液（ng/ml）Standard AFP solutions from the kit（ng/ml）B

Figure 2 Comparison between hAFP ELISA kit (ABCam) and the homemade one (A: Standard curves ; B: Linear standard curves)

表 3 样品检测结果

3 讨论

自 1975 年淋巴细胞杂交瘤技术诞生以来，单抗制备技术迅猛发展，开启了检测试剂盒研发和靶向治疗的新时代，成为了现代科技转化为实际应用的最重要代表之一[9]。人甲胎蛋白作为原发性肝癌最特异的肿瘤标志物和产前诊断检测分子，其单克隆抗体具有极其重要的实际应用意义。虽然国内外均已成功制备了抗 hAFP 单抗并应用于试剂盒生产[10-11]，但不断开发具有更高灵敏度、更好线性检测范围的双抗体夹心配对抗体仍是试剂盒研发的努力方向，也是临床检测的需要。

目前，血清 hAFP 的检测方法主要是双抗体夹心 ELISA 试剂盒法，该方法对其使用的配对抗体具有较高要求，两个配对抗体不仅需要高特异性、高亲和力，还需要具有稳定的抗原结合活性，其对应抗原结合位点之间的空间位置关系也同样直接影响该抗体对的检测灵敏度和检测范围。本研究从制备所得的 12 株抗 hAFP 单克隆抗体中成功筛选出 5 对有应用价值的配对抗体，并最终建立了以 Ab 1 + Ab 3 为捕获抗体、Ab 2 或 Ab 4 为检测抗体的 DAS-ELISA 检测方法，其线性检测范围为 5 ~ 250 ng/ml，检测下限 2 ng/ml，均优于 ABCam 进口试剂盒，且血样检测结果显示其具有很好的检测准确度，表明该初步建立的 DAS-ELISA 检测方法具有较好的临床应用价值。

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Preparation of monoclonal antibodies against hAFP and development of mAb-based sandwich ELISA

SUN Yi-fan, YANG Quan-li, HUANG Jian-fang, ZHAO Feng-zhi, XIANG Jun-jian

To prepare several hAFP-specific monoclonal antibodies with high specificity and high affinity. To screen antibody pairs with potential commercial value from these mAbs and to develop a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (DAS-ELISA) for the detection of hAFP.

mAbs were prepared using the classic hybridoma fusion method, and the specificity of mAb was identified and analyzed. Using DAS-ELISA, the best antibody pair was selected from the mAbs. DAS-ELISA was optimized and compared to an ABCam ELISA kit. Then the initially self-made kit was used to detect a total of 160 samples (including 120 positive and 40 negative serums).

A total of 12 mAbs was prepared and 5 of them had very high affinities. The titers of ascites of both Ab 1 - Ab 5 were less than 1: 6 million and Ab 5 had the best titer: 1:30 million. Both Ab 1 - Ab 5 could recognize the natural hAFP specifically, but Ab 5 had cross-reaction with HSA. In the selected antibody pairs, Ab 1/HRP-Ab 2, Ab 1/HRP-Ab 4, Ab 3/HRP-Ab 2, Ab 3/HRP-Ab 4 and Ab 4/HRP-Ab 1 were identified to be capable of application. Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 2 and Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 4 were identified as the best antibody pairs to establish the DAS-ELISA kit. The self-made kit had better linear scale of detection (5 - 250 ng/ml) than that of ABCam kit (5 - 200 ng/ml), and better limitation of detection (2 ng/ml) than that of ABCam (5 ng/ml). The self-made kit also showed good results in detecting the samples with accuracies of 99.2% (119/120) in positive serums and 100% (40/40) in negative serums.

4 mAbs ( including capture mAbs Ab 1 and Ab 3 and detection mAbs Ab 2 and Ab 4) with high affinity and specificity are used in developing the DAS-ELISA kit. The better linear scale and limitation of detection also suggest that this kit would have good commercial value.

Alpha-fetoproteins; Antibodies, monoclonal; Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay

XIANG Jun-jian, Email: txjj@jnu.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.004

广东省战略性新兴产业核心技术攻关项目“免疫荧光定量快速检测技术在重大疾病检测中的应用”（2012A080800007）

向军俭，Email：txjj@jnu.edu.cn

2014-06-09

Author Affiliation: Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering/ Research Center for Antibody Engineering, Jinan University,Guangzhou 510632, China