巴克夏猪氟烷基因PCR—RFLP分析

郭咪咪　梅书棋　乔木　吴俊静　李助南

摘要：为选育抗应激巴克夏猪群新品系，采用PCR-RFLP技术检测了156头巴克夏猪氟烷基因的基因型分布情况。结果表明，在试验猪群中氟烷显性基因HalN频率和隐性基因Haln频率分别为1.00和0，该猪群已实现氟烷隐性基因的剔除。猪氟烷基因PCR-RFLP分析技术为优质猪的培育提供了理论依据。

关键词：巴克夏猪；氟烷基因；PCR-RFLP

中图分类号：S813.3 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）08-0005-03

猪的应激综合征（ porcine stress syndrome，PSS） 指猪在外界应激条件刺激下产生的肌肉强直收缩，并伴随体温急剧升高，心跳加快，皮肤发绀等一系列恶性高温综合症状，一些个体在应激过程中往往突然死亡或宰后出现 PSE肉[1]。PSS是由于氟烷基因（Halothane，HAL）或称骨骼肌兰尼定受体基因（Ryanodine ReceptorGene，RYR1）突变所致，兰尼定受体基因CDS序列的 C1843-T1843突变致使受体蛋白的第615位的氨基酸发生变异（Arg-Cys），引起蛋白结构和功能的改变；这种改变使猪在应激状态下肌肉组织中大量的 Ca2+异常释放，引起血浆β-内啡呔过量分泌，电解质代谢出现紊乱，发生肌肉持续收缩，进而使猪产生恶性高热；肌肉组织收缩需要大量能量，氧化分解供能不足，需要依靠糖酵解来获得能量，致使乳酸产生过多，肌肉pH异常降低，出现PSE肉[2]。

猪氟烷基因的检测方法先后有氟烷测定法、血液遗传标记选择法、CK 血清水平测定法和 DNA 诊断法[ 3，4]。目前普遍应用的是聚合酶链反应结合限制性内切酶技术（polymerase chain reaction-restriction endonuclease fragment length polymophism，PCR-RFLP） ，该技术快速、准确、便捷、样品来源广泛（ 猪毛、血液、肌肉、耳组织等均可），且所需的样品量极少，只需少量的全血、肌肉组织甚至几根猪毛即可准确的检测出猪的氟烷基因型[5-8]。

氟烷基因隐性纯合子的存在降低了猪肉品质，对猪肉加工及销售造成了严重影响，制约了现代养猪业发展。本试验从巴克夏猪群中提取DNA，采用PCR-RFLP方法对巴克夏猪群进行氟烷基因检测，以指导种猪的选育。

1 材料与方法

1.1 试验动物

所检测的156头巴克夏猪来自湖北省农业科学院畜牧兽医研究所良种育种猪场。用耳号钳取火柴头大小的耳组织，每个个体采集耳组织样1 g左右，-20 ℃冷冻保存 。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：组织细胞基因组DNA提取试剂盒购自艾德莱生物公司；引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，HhaⅠ限制性内切酶购自湖北晶茂生物技术有限公司

主要仪器：DNA Engine PCR仪、DYY-6B电泳仪（北京市六一仪器厂），超微量分光光度计Photometer（北京天翔飞域仪器设备有限公司），LRH-250F生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），美国Bio-rad伯乐凝胶成像系统（联想生物科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA的提取 采用组织基因组DNA提取试剂盒（购自艾德莱生物公司），按照试剂盒步骤提取基因组DNA，将提取后的DNA置于-20 ℃保存。

1.3.2 引物设计 引物合成参考文献报道的序列设计[3]。上游引物： 5-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA- 3；下游引物： 5-ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3。

1.3.3 PCR反应 PCR反应体系如下：lμL PrimerⅠ（10 Umol/L），1μL PrimerⅡ（10 Umol/L），10μL 2×Taq Master Mix，DNA模板2μL，加去离子水至总体积20 μL。

PCR反应程序：94 ℃预变性4 min；然后4 ℃变性40 s，67 ℃复性40 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物置于4 ℃保存，各取5μLPCR产物与分子质量2 000 bp Marker同时进行1%琼脂糖电泳（130V）25 min检测，在凝胶成像系统中扫描成像。

1.3.4 扩增产物的HhaⅠ-RFLP分析 按HhaⅠ内切酶说明书要求，取6μLPCR产物，1μL10×Buffer Tango，0.5μL HhaⅠ内切酶（ 10 U/ULl），加ddH2O 至总体积10μL。在37 ℃温育酶切过夜，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V）25 min分别对酶切产物进行检测，成像系统观察并记录酶切结果。

2 结果与分析

2.1 DNA提取

采用组织基因组DNA提取试剂盒，提取156头巴克夏猪耳组织的基因组DNA，琼脂糖电泳结果（图1）表明，DNA的纯度高，无RNA、蛋白质和多糖杂质，经超微量分光光度计检测OD值和DNA浓度均符合后续试验的需求。

图1 猪基因组DNA提取结果

2.2 氟烷基因PCR扩增

从猪耳组织样品中提取基因组DNA，采用设计的引物PCR扩增后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测均显示单一明亮条带，其长度为659 bp的DNA片段 （图2）。

图2 猪Hal基因PCR扩增电泳图谱

2.3 氟烷基因酶切HhaⅠ-RFLP结果

HhaI限制性内切酶可识别野生型HalN基因的5-GCG↓C-3即C位点，经PCR产物长度为659 bp，当氟烷基因未发生突变时，经HhaⅠ酶切后产生两个片段，长度分别为493 bp和166 bp，基因型为HalNN；当第1843位碱基发生C→T突变时，不能被HhaⅠ识别，酶切后只有一个片段，长度为659 bp，基因型为Halnn；当一个氟烷等位基因发生突变，而另一个正常，经HhaⅠ酶切后产生3个片段，分别是659 bp，493 bp和166 bp，基因型为HalNn。

本次检测各样品所获659 bp的PCR产物，经HhaⅠ限制性内切酶酶切，均出现大小在493 bp和166 bp被完全切割的两条条带，无659 bp条带残留（图3）。

图3 猪Hal基因HhaⅠ-RFLP多态分型结果

2.4 猪Hal基因基因型和基因频率

由表1可见，所检测种猪群中NN基因型为1.00，Nn和nn基因型均为0，N基因频率为1.00，n基因频率为0。被检猪群氟烷基因型均为显性纯合子HalNN，未发现氟烷基因隐性纯合子Halnn和氟烷杂合子HalNn，不含有氟烷敏感基因Haln。

3 小结与讨论

影响猪肉品质的因素主要包括遗传因素、营养因素和环境因素，其中遗传因素是影响猪肉性状的重要因素之一。DNA标记辅助选择（简称MAS）为猪的育种提供了一个新的突破性方法，猪育种中的若干重要DNA标记的理论研究和实践应用促进了猪的育种发展。PCR-RFLP是目前普遍应用的检测猪氟烷基因方法，采用PCR扩增的目的片段，经限制性内切酶温育消化后，对扩增产物进行电泳，根据酶切片段长度多态性识别应激敏感猪和抗应激猪。

研究表明[9，10]，猪氟烷敏感基因（Haln）具有多效性，一方面导致肌肉肥大，提高胴体瘦肉率；另一方面易诱导发生 MHS（malignant hyperthermiasy ndrome，恶性高热综合征），产生PSE肉，降低肌肉品质，猪的肉质性状、生长发育性状和繁殖性状都逐渐变劣，而氟烷基因杂合子猪在生产性能和体型外貌上具有杂合优势，更易被选作种用。Pommier 等[11]认为 NN、Nn和 nn基因型表现为PSE肉的几率分别是 53.8%，79.8% 和 90.9%。蒋思文等[12]报道猪氟烷基因Halnn比HalNN、HalNn杂合子每窝产仔数和活仔数少2.0～2.7头，繁殖性能NN﹥Nn﹥nn；鞠慧萍等[13]研究表明，氟烷敏感基因可导致总产仔数、产活仔数和断奶仔猪数下降，初生窝重和个体断奶重降低，并使生长速度减慢，即Haln对繁殖性能有较显著的不良影响。综合考虑巴克夏猪在我国商品猪繁育体系中的作用，对Haln基因的利弊进行权衡，认为利用成熟的氟烷基因分子标记辅助选择对巴克夏猪群的Haln基因进行剔除，结合适当的选育措施，建立抗应激猪群，提高种猪质量。伍少钦等[2]对加系长白、加系大白和丹系长白和丹系长白的公猪和母猪的氟烷基因进行了检测，结果显示均未发现隐性纯合氟烷基因型（Halnn）和杂合氟烷基因型（HalNn）。宋忠旭等[14]在2005年采用PCR-RFLP方法对湖北省农业科学院畜牧兽医研究所种猪场的大白猪进行了氟烷基因的检测，结果显示，检测的151头大白猪中基因型均为NN，未检出Nn和nn基因型。本次试验检测的156头巴克夏猪群中基因型均为NN，说明在该良种猪育种场已基本实现氟烷敏感基因Haln的淘汰，组建了高繁殖力、抗应激猪群，为新品系的选育奠定了基础。

参考文献：

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[14] 宋忠旭，彭先文，梅书棋，等.氟烷基因标记辅助选择技术在大白猪选育中的应用[J].养殖与饲料，2006（10）：25-26.