机械拉伸对兔角膜成纤维细胞增殖和迁移的影响

刘成星，李晓娜，冯鹏飞，安美文，陈维毅

（太原理工大学 应用力学与生物医学工程研究所，太原 030024）

角膜是影响视觉的重要组织。由于眼压的波动，人角膜在生理性情况下即发生周期性变形[1]。眼屈光手术使角膜受到了一定程度的机械损伤，也改变了角膜所处的力学环境[2]。角膜基质细胞受损后首先发生凋亡，随后角膜基质细胞发生增殖和迁移，并转化成角膜成纤维细胞和肌成纤维细胞，对受损角膜进行损伤修复[3]。研究表明，一些细胞因子如EGF和bFGF在角膜细胞的增殖和迁移过程中发挥了重要作用[4-5]；机械牵拉能够影响细胞的增殖[6-7]和迁移[8-9]。而有关力学刺激对角膜细胞的增殖迁移影响尚未见报道。本文通过对兔角膜成纤维细胞进行周期性机械拉伸，探讨力学刺激在角膜成纤维细胞增殖及迁移中的作用。

1 材料和方法

1.1 兔角膜成纤维细胞的原代提取、培养

本研究采用酶消化法获取原代兔角膜成纤维细胞[10]。首先机械剥离上皮层和内皮层，然后用2 mg／mL的Ⅱ型胶原酶消化组织块，直至培养液完全清亮，离心后获得角膜成纤维细胞，加入胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）体积分数为10%的F12培养基，置于37℃、二氧化碳体积分数为5%的孵箱内培养。实验使用2～5代细胞。

1.2 周期性力学加载

采用Flexcell4000柔性基底拉伸系统（美国Flexcell）对细胞实施周期性机械拉伸。将角膜成纤维细胞用质量分数0.25%胰蛋白酶消化，以3×105的密度接种于裱衬有I型胶原蛋白的BioFlex＠六孔培养板（美国Flexcell）上，置于孵箱内培养。待细胞80%融合时，进行5%拉伸应变、0.1Hz正弦波的力学加载，卸载后进行细胞周期检测和划痕实验。

1.3 细胞周期检测

用胎牛血清体积分数为10%的培养基培养细胞。卸载后12，24，36h收集细胞。细胞经4℃预冷、体积分数为70%的乙醇固定，采用细胞周期检测试剂盒（南京凯基）通过流式细胞仪（德国Beckman）对细胞周期进行检测，用S期（Synthesis phase，DNA合成期）占整个细胞周期的百分比表示细胞增殖情况。S期所占百分比越高，说明细胞增殖越旺盛。实验重复3次，取均值。

1.4 划痕实验

如图1所示，接种细胞前，在培养皿底壁外侧用标记笔划十字线。在Flexcell4000加载时，12.7 mm半径之内（图1白色区域）细胞主要受等双轴拉伸；半径12.7～17.8mm范围内（图1浅灰色环形区域），细胞主要受单轴拉伸[11]。加载前用10μL枪头在等双轴拉伸区域沿与标记线垂直方向划痕，在单轴拉伸区域沿标记线平行方向划痕。所有划痕均与力的方向垂直。图1中短直线代表划痕，箭头代表牵张力的方向。

先用FBS体积分数为2%的培养基饥饿细胞12h，使细胞周期同步化。划痕后，用PBS清洗，去除死细胞，换成FBS体积分数1%的F12培养基。然后添加1ng／mL重构人表皮生长因子（rhEGF）或100ng／mL重构人碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF）（美国PeproTech），以FBS体积分数1%组作为对照。分别于0，5，10，20h拍照，测量各时刻的划痕面积，用不同时间点的划痕面积除以初始（0h）划痕面积，获得与初始面积的百分比。由于所取划痕长度相同，因此该比值即相对划痕宽度。相对划痕宽度越小，说明细胞迁移速度越快。每个区域做8个划痕，取均值。

图1 体外划痕实验示意图

1.5 数据分析

实验结果以x±S表示。采用SPSS13.0统计分析软件中单因素方差分析方法对数据进行统计学处理，p＜0.05为具有统计学差异。

2 实验结果

2.1 周期性机械拉伸对角膜成纤维细胞增殖的影响

流式细胞仪检测结果显示，兔角膜成纤维细胞在12h相对分裂最旺盛，S期占整个细胞周期的41.17%；随着培养时间的增加，S期占细胞周期的比例明显降低，36h下降为19.99%（图2-a）。与各自静态对照组相比，5%拉伸使S期细胞比例均有所增高。拉伸12h，S期虽为静态对照组的1.12倍，但无统计学差异（p＞0.05）；拉伸24h和36h时，S期分别为静态对照组的1.22和1.24倍，具有显著差异（p＜0.05）（图2-b）。

图2 体外周期性机械拉伸对角膜成纤维细胞增殖的影响

2.2 周期性机械拉伸对角膜成纤维细胞迁移的影响

首先我们研究了bFGF与EGF对细胞迁移的影响。划痕实验结果表明：无论是拉伸组还是静态对照组，相对划痕宽度均随时间增加而减小（图3至图5），说明细胞在损伤后均表现出不同程度的迁移行为。在未拉伸培养条件下，5h时，与1%FBS对照组相比，施加bFGF或EGF对相对划痕宽度无明显影响（p＞0.05）；10h后bFGF或EGF对细胞迁移行为的影响逐渐显现，表现为其相对划痕宽度明显小于1%FBS对照组（p＜0.05）；拉伸条件下具有同样趋势（图4）。说明bFGF和EFG对细胞迁移均具有促进作用，EFG作用效果略优于bFGF，但二者之间无显著差别（p＞0.05）。

其次，我们研究了拉伸对角膜成纤维细胞迁移的影响。结果表明：实施5%的周期性拉伸5h，与各自静态对照组相比，无论是等双轴还是单轴拉伸，相对划痕宽度均无明显差异（p＞0.05）；10h时，等双轴拉伸组相对划痕宽度虽较各自静态对照组有所增加，但二者无统计学差异（p＞0.05），而单轴拉伸组细胞迁移则明显受到抑制，表现为相对划痕宽度显著大于静态对照组（p＜0.05）；20h时，无论是等双轴拉伸还是单轴拉伸，拉伸组相对划痕宽度均明显大于各自静态对照组（p＜0.05）。说明拉伸抑制了角膜成纤维细胞的迁移，且抑制效应具有时间依赖性，拉伸时间越长，抑制效应越明显。单轴拉伸对细胞迁移的抑制效应早于且强于等双轴拉伸。

3 讨论

角膜受损后，角膜基质由于水肿而发生膨胀，在伤口边缘的基质细胞首先发生凋亡。基质细胞在生长因子和细胞因子的作用下向伤口处迁移、增殖，并合成各种细胞外基质，对角膜进行损伤修复。因此角膜成纤维细胞的增殖和迁移对角膜基质损伤修复具有重要意义。

如前所述，角膜本身在眼压的周期性波动下就受到周期性牵拉的作用，屈光手术由于对基质进行了切削则使角膜受到的拉应力增大。但有关机械拉伸对角膜基质细胞的增殖和迁移的影响目前尚未见报道。我们通过对兔角膜成纤维细胞进行周期性机械拉伸后发现，低幅度的机械拉伸能够促进兔角膜成纤维细胞增殖，但抑制了细胞迁移行为；bFGF和EGF能够促进细胞迁移行为，因此一定程度上减弱了由牵拉引起的细胞迁移抑制效应；拉伸方式对迁移行为有影响。

据有关文献报道，机械应力能够影响细胞增殖[6-7]。本研究结果提示机械牵拉可以通过促进细胞的增殖来影响角膜成纤维细胞的生物学行为，这对损伤后角膜组织早期修复具有积极意义。如屈光手术后，少量的基质切削造成组织损伤的同时使角膜拉应力增大。在这种情况下，拉应力通过促进细胞增殖而有利于损伤后角膜组织的修复，这种行为是生物体自我保护的体现。

图5 单轴周期性拉伸对角膜成纤维细胞迁移的影响

角膜损伤后上皮细胞分泌各种细胞因子和生长因子（如bFGF），并刺激泪腺分泌EGF。角膜成纤维细胞也可以产生各种生长因子并表达相应受体，其中包括bFGF和EGF及其受体。这些生长因子通过自分泌或旁分泌方式调节角膜成纤维细胞的增殖和迁移行为[12]。研究表明bFGF和EGF均可以促进角膜成纤维细胞迁移，并具有剂量依赖性[4-5]。实验也证实施加100ng／mL bFGF或1ng／mL EGF 10h后明显促进了兔角膜成纤维细胞的迁移。此外，bFGF及EGF还可以减弱由拉伸引起的细胞迁移抑制行为。如5%等双轴拉伸20h，bFGF和EGF作用组相对划痕宽度分别为（44.11±9.81）%和（51.66±5.31）%，与1%FBS静态对照组的（46.24±3.91）%相当。这说明细胞生长因子bFGF和EGF能够使角膜成纤维细胞在受拉状态下保持适宜的迁移速度，从而有利于角膜的损伤修复。

本研究结果表明，5%、0.1Hz的周期性机械拉伸能够抑制角膜成纤维细胞的迁移行为。这与Savla U等[8，13-14]的结果一致。周期性牵拉引起的气道上皮细胞迁移行为受抑与FAK-JIP3-JNK（FAK：Focal Adhesion Kinase，局部粘附斑；JIP3：JNK-interacting protein 3，JNK相互作用蛋白3；JNK：c-Jun N-terminal Kinase，c-jun氨基末端激酶）信号途径有关[13-14]。而对牛动脉血管内皮细胞施加5%、1Hz的双轴周期性牵拉24h，用Transwell小室检测细胞的迁移情况则发现，拉伸能够促进动脉血管内皮细胞迁移，拉伸组迁移细胞数目是静态对照组的1.83倍[9]。该研究结果与我们及U.Savla等的结论相反，这可能与细胞种类及体外检测细胞迁移的方法有关。Transwell小室主要检测细胞在三维基质环境中的迁移行为，细胞迁移的快慢除与细胞本身运动能力相关外，还与细胞分泌的降解细胞外基质的蛋白（如基质金属蛋白酶）量有关。而细胞体外划痕实验，主要考察二维培养条件下细胞的运动变形能力。

此外，研究还发现角膜成纤维细胞的迁移行为与力学载荷的作用方式有关。单轴拉伸对角膜成纤维细胞的迁移行为抑制效应比等双轴拉伸明显。T.A.Hornberger等[15]发现等双轴拉伸和单轴拉伸均可以使C2C12细胞的细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB／Akt）磷酸化水平增高，但仅等双轴拉伸可以引起核糖体S6激酶（Ribosomal S6kinase，p70S6k）磷酸化，这提示细胞对不同方式力学刺激的信号响应机制不同。

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