集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统

2014-10-24赵树弥朱灵朱灿灿等

分析化学 2014年10期

赵树弥+朱灵+朱灿灿等

摘要集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统将核酸提取、PCR扩增与实时荧光检测进行整合，在同一块微流控芯片上实现了核酸分析过程的全自动和全封闭，具有试剂用量少、分析速度快、操作简便等优点。本研究采用微机械加工技术制作集成核酸提取微流控芯片的阳极模，使用组合模具法和注塑法制作具有3D通道的PDMS基片，与玻璃基底通过等离子体键合封装成集成核酸提取芯片。构建了由微流体速度可调节（0～10 mL/min）的驱动控制装置、温控精度可达0.1 ℃的TEC温控平台、CCD检测功能模块等组成的微全分析系统。以人类血液裂解液为样品，采用硅胶膜进行芯片上核酸提取。系统根据设置好的时序自动执行，以2 mL/min的流体驱动速度完成20 μL裂解液上样、清洗；以1 mL/min的流体驱动速度完成DNA洗脱，抽取PCR试剂与之混合注入到反应腔。提取的基因组DNA以链上内参基因GAPDH为检测对象，并以传统手工提取为对照，在该系统平台上进行PCR扩增和熔解曲线分析实验。片上PCR扩增结果显示，扩增曲线明显，Ct值分别为25.3和26.9。扩增产物进行熔解曲线分析得到的熔解温度一致，均为89.9 ℃。结果表明，此系统能够自动化、全封闭的在微流控芯片上完成核酸提取、PCR扩增与实时定量分析。关键词核酸提取；微全分析系统；实时荧光PCR；微流控芯片

核酸作为基本的遗传物质，携带着各种信息，对其结构、功能的认识，有利于研究物种的遗传、进化以及疾病诊断等[1]。微流控芯片在核酸分析方面有着广泛和极其重要的应用，如基因突变检测[2]、病原体基因鉴定[3，4]、SNP（Single nucleotide polymorphism）分析[5]等。传统的PCR（Polymerase chain reaction）技术虽然能实现DNA的扩增检测，但其检测结果受人为因素的影响较大，需要专业技术人员和实验室设备，而荧光定量PCR技术和微流控技术的相结合，能实现核酸操作过程的自动化、全封闭，简化了人工的操作过程，避免了过程污染，提高了核酸检测的效率和准确性[6～8]。集成核酸提取功能的实时荧光PCR微全分析系统将样品前处理、PCR扩增与荧光检测功能模块集成，能直接给出分析结果，可实现“样品进结果出”这一目标。因此，微全分析系统现已成为分析仪器和分析科学发展的重要方向和前沿[9～11]。

集成化的微流控芯片通常将微流体控制与分析单元集成在芯片上，如微泵、微阀、微加热器、微混合器、微流量控制器以及微检测器等，使体积微型化和功能集成化，在较短时间内精确完成从样品制备到结果显示的全部过程[12～14]。尽管大规模集成的微全分析系统还处在实验室研究阶段，但随着微流控芯片的运用与发展[15～17]，针对特定功能的微流控芯片及系统发展迅速[18，19]，如静态腔式微流控PCR系统[20]、具有样品前处理功能的核酸提取系统[21，22]、集成化的温控系统[23]、微型化的检测系统[24]。目前，由于各功能模块的研究突破，促进了集成化的发展，但形成一个完整的集成化系统还存在着很大的技术难度[25，19]。

本实验基于固相萃取法[26]，采用硅胶膜提取核酸[27]，设计并制作了集成核酸提取的微流控芯片。使用自主研发的实时荧光PCR微全分析系统，成功提取了人全血中的基因组DNA，对基因组上稳定表达的内参基因甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）进行PCR扩增检测。开展了传统手工提取核酸的对照试验，通过对比，验证了集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统的可行性，实现了在同一块微流控芯片上完成核酸的提取与分析过程。2实验部分

2.1芯片设计与制作

通过微机械加工技术[28]在一个很小体积的金属块上加工各种微小型腔体，然后把它们作为一个镶块嵌入模板并进行整体组装，组装成的模具示意图如图1A所示，模具尺寸为40 mm×50 mm×10 mm，制作芯片的实物如图1B所示。C1是Buffer Aw1试剂腔，C2是Buffer Aw2试剂腔，C4是AE试剂腔，C5是PCR反应试剂腔，C1～C3的体积均为110 μL，C4～C6的体积均为50 μL；E是50 μL的提取腔；W是224 μL的废液腔；M是50 μL的混合腔；扁平形的PCR反应腔体积为20 μL。

图1模具示意图（A）和集成核酸提取芯片（B）

Fig.1Schematic diagram of chip mold （A） and integrated DNA extraction chip （B）核酸提取芯片的制作采用模具组合法[29，30]生成，这不仅便于微小型腔的微细加工和镶块的更换，而且能够提高模具整体的使用寿命。嵌入体在PDMS胶水（Sylgard 184， DowCorning）中构成3D结构，这种3D的通道可以像立交桥分层相互独立贯穿整个空间，实现了真正意义上的3D通道。固化后的PDMS 表面具有一定的粘附力，可借助分子间的引力自然与玻璃基板进行粘合，但这种粘合强度有限，容易发生漏液。本研究采用氧等离子体键合的方法[31]处理PDMS 芯片与玻璃基片35 s，改善了PDMS和玻璃表面活性，然后贴合放置在90 ℃的恒温箱烘烤30 min，使芯片成为永久性粘合。分析化学第42卷第10期赵树弥等：集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统

2.2芯片的驱动控制

微机械加工技术在芯片上制备出精细和复杂的几何通道结构，可利用通道自身特性和特征进行微流体的流动控制[32]。由于微通道中表面积与体积之比非常大，表面效应极大影响流体流动，给微流体驱动和控制带来了困难。芯片上的操作过程包括细胞裂解液加载，硅胶膜上DNA吸附、清洗、洗脱，反应试剂的混合以及PCR反应。在对微流体特性进行深入分析的基础上，开发了一套相应的驱动控制装置。硬件设备主要包括FPGA核心电路板、阵列电磁阀、气体质量流量控制器、微型真空泵。阵列电磁阀上配置压力传感器和减压阀；微真空泵的最大真空度为60 kPa，最大流速为15 L/min；气体质量流量控制器的对流体的流速控制范围在0～10 mL/min。FPGA电路控制阵列电磁阀为芯片上流体的操控提供时序控制，外置气动泵和流量控制器对微流体进行可调节的驱动和控制。

2.3实时荧光PCR分析装置

实时荧光定量PCR分析装置集成了三大功能模块：工控机、CCD荧光检测模块和半导体温控模块，如图2A所示。工控机控制系统是分析平台的操控中心，不仅协调各模块的操作控制，还对数据进行处理分析。CCD荧光检测模块的总体性能将影响整个分析系统的检出限、检测速度、适用范围等指标[24]，其结构如图2B所示，主要由微流控芯片、LED光源、CCD探测器三部分组成。CCD探测器性能以荧光素钠模拟测试达到了5×1010mol/L，实现了高灵敏度的探测。温控是PCR正常进行的关键，温控的准确性决定了PCR扩增的成败。本实验采用半导体制冷器（TEC）来控制微流控PCR芯片的温度，通过PID算法[33]来实现温度循环的快速准确控制，温控平台如图2C所示。PCR温控系统升温速率为7.2 ℃/s，降温速率为5 ℃/s，温控精度达到了0.1 ℃，完全能够满足PCR温度控制的需求。本实验制作的PDMS基片厚度为7.5 mm，PDMS材料本身导热性差，使得腔内反应温度不受外界影响。腔内的温度变化主要通过玻璃与TEC热交换实现。反应腔的体积为20 μL，属于大体系下的PCR反应[20]。PCR实验中，反应温度设置均低于水的沸点，腔内水分快速蒸发渗透到外表面难以发生。

2.5实验方法

血液按照裂解试剂盒（QIAamp DNA Micro Kit）说明书进行裂解，然后将裂解过的血溶液（20 μL）加载到微流控芯片上，启动微全分析系统。手工提取核酸使用离心机按照试剂盒标准提取方法进行[27]。提取完成之后取约为2 μL DNA原液与20 μL PCR反应试剂混合，注入到芯片的PCR反应腔进行扩增检测。无论是芯片上自动提取的核酸，还是手工提取的核酸，扩增检测均使用同一条件。根据所选的基因片段设置反应所需要的条件：预变性阶段95 ℃保持160 s后直接进入循环扩增阶段；95 ℃保持15 s，降温至60 ℃保持40 s，然后在72 ℃保持60 s，执行40次循环；设置熔解的升温步长为1 ℃/s，每个步长保持时间为5 s。仪器根据设置好的参数进行PCR扩增检测，给出分析结果。

3结果与讨论

3.1微流体驱动与控制分析

集成核酸提取的PCR芯片流体通道为200～500 μm之间，提取过程中微流体在不同尺度的微通道内多次交替，要求流体的驱动力不同，因此，微流体的驱动和控制尤其显得困难。这种流动特性的变化使得宏观流体驱动与控制技术在微流体中的简单移植往往不成功或者效果不好。本研究根据集成核酸提取的微流控芯片的驱动和控制要求，对于裂解液的废液抽取，Buffer Aw1、Buffer Aw2的驱动均采用2 mL/min的速度控制。对于洗脱液AE、PCR反应试剂驱动，PCR反应腔溶液的注入均采用1 mL/min的速度控制。气体流量控制器根据不同时段、不同量的驱动，采用不同的驱动参数，实现可变的控制，满足了实验过程中的微流体运动的控制和驱动。

3.2核酸提取过程分析

芯片上核酸提取过程的原理如图3所示。在实物图中，C0是提取腔里的一部分，提取腔E底层为微通道连接，中间层是硅胶膜，上层是血液加载腔；V1～V8是微阀连接微泵的通道，+号表示往管道施加正压；号是表示施加负压，气路处于抽取空气状态。芯片上的操作过程包括FPGA控制系统首先启动1号和5号电磁阀，抽取裂解液中的废液至废液腔；其次启动2号电磁阀，气动驱动50 μL Buffer Aw1到吸附柱中，洗涤DNA中杂质；30 s后启动5号电磁阀抽取废液；废液排空后，启动3号电磁阀，驱动50 μL Buffer Aw2到吸附柱中，再次洗涤DNA中杂质；30 s后再次启动5号电磁阀抽取废液；待洗涤液除尽后，继续抽吸吸附柱，直到吸附膜干燥后关闭；启动4号电磁阀，加入10 μL AE到吸附柱中，洗脱DNA，打开7号电磁阀抽约2 μL至混合腔；启动6号电磁阀，推入PCR反应试剂20 μL到混合腔；最后启动8号电磁阀，抽取混合腔溶液至PCR反应腔，对PCR反应腔两端进行密封，即可开始PCR扩增与熔解检测分析。

Fig.3Schematic diagrams of nucleic acid extraction提取腔中的硅胶膜具有在高盐低pH条件下能吸附DNA，低盐高pH条件下释放DNA的特性。在提取过程中通过Buffer Aw1的冲洗作用去除硅胶膜上吸附的蛋白、脂质等杂质，以获得高质量基因组DNA；通过Buffer Aw2的冲洗作用去除残留乙醇，避免影响后续的酶促反应（PCR或酶切）；通过洗脱液TE的作用将膜上结合的DNA洗脱至溶液中，同时利于基因组DNA 充分溶解。混合腔利用重力溶合PCR试剂和DNA溶液，经过S通道又进一步混合[34]。整个DNA的提取到PCR反应，过程操作快速、简便。

3.3核酸的扩增检测分析

对于提取的DNA通过PCR扩增进行检测，首先加热使DNA双链在95℃解链变为两条单链，然后降温至延伸阶段，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则，DNA单链合成双链，数量成倍增加，实现DNA的指数扩增。SYBR Green荧光染料能与DNA双链结合，通过中心波长约为497 nm的LED激发光激发能够发出波长约为520 nm的荧光[35]。在延伸期，利用CCD检测荧光信号的强度，就能实现DNA序列扩增量的实时监测。因此，在PCR扩增体系内，荧光信号强度代表了双链DNA分子的数量。本研究针对提取的DNA链上的GAPDH基因，自行设计引物，进行了PCR扩增与熔解曲线分析。通过分析GAPDH基因的检测结果，可以对DNA提取效率以及提取质量加以判别分析。

本研究对两种提取方法进行了对比实验。在图4中曲线1、2为手工提取核酸的扩增曲线，曲线3、4为芯片上自动提取核酸的扩增曲线。从图4A可见，手工提取与芯片法提取的DNA链上的GAPDH基因在PCR反应后均获得了明显的扩增，手工提取法的Ct值（反应腔内荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数）分别是22.5和23.0，芯片法的Ct值分别为25.3和26.9，结果表明均实现了基因组DNA的提取与GAPDH基因的扩增检测。从熔解曲线图4B可见，均有统一的熔解温度值89.9℃，表明了芯片法提取结果的准确性。由于手工提取与芯片自动提取使用的裂解液量与洗脱液量比例不同，提取的DNA浓度有差异，所以扩增曲线不完全重合。但是从熔解曲线可以看出，单一的熔解峰，相一致的熔解温度值表明了扩增产物是来自基因组DNA的同一个基因片段，而且提取的基因组DNA纯度高、质量好。

4结论

本实验成功研制了集成核酸提取的PCR芯片以及芯片的驱动控制、检测、分析系统，并成功地从人体全血的裂解液中提取了基因组DNA，并进行了GAPDH基因的扩增与检测，通过实验对比验证了系统的可行性与结果的正确性。芯片上核酸提取使用的试剂量几乎是传统法的1/10，而且全自动化、全封闭的操作，大大改善了传统操作技术耗时长、试剂消耗量大、操作步骤繁琐、操作过程易受污染等缺点。本研究使得集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统本身具有的快速、高灵敏度、低消耗、易于集成化、便携化的独特优势更好、更充分的发挥出来，提高了微流控芯片的自动化操作水平。

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