大豆根际解磷菌的鉴定

李丽丽+郎敬+杨洪一+邰飞飞+来永才

摘要：利用PVK平板，从大豆根际土壤中分离出8株解磷菌。培养分析结果显示，这8株解磷菌的溶磷圈均较大。其中，海伦Ⅲ号为革兰氏阴性菌，其余均为革兰氏阳性菌。形态学观察结果显示，北安Ⅰ号为链球菌，海伦Ⅱ号、海伦Ⅲ号为球菌，海伦Ⅳ号、北安Ⅲ号为杆菌。基于细菌核糖体16S rDNA序列对北安Ⅲ号菌株进行鉴定，结合形态特征确认该菌株为巨大芽孢杆菌，经研究发现该菌株是一种重要的微生物资源，可进一步开发为生物磷肥。

关键词：解磷菌；溶磷圈；16S rDNA；大豆；生物磷肥

中图分类号：S154.3 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0363-03

土壤中存在一些特定的微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，这些微生物被称为解磷菌，以细菌为主^[1]。将解磷菌作为肥料施入土壤，通过其生长代谢可以在作物根际形成一个磷供应较充分的微区，从而改善作物磷元素的供应，增加作物磷素吸收量，提高作物产量，同时还可以增进土壤肥力、增强植物抗病和抗旱能力^[2]。因此，解磷菌的筛选及鉴定是当前微生物学研究的热点。土壤中解磷微生物种类丰富、数量较多^[2]，目前报道的具有解磷作用的细菌有芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、固氮菌属（Azotobacte）、根瘤菌属（Bradxrkizobium）、硫杆菌属（Thiobacillus）、肠细菌属（Enterbacter）、微球菌属（Microeoccus）、沙门氏菌属（Salmonella）、色杆菌属（Clromobacterium）、产碱菌属（Alcaligenes）、节细菌属（Arthrobacte）、大肠杆菌属（Escherichia）等^[3]。解磷微生物在我国应用较早，有较好的应用前景，但发展不快，应用还不普遍。筛选高效微生物肥料菌株手段单一、菌种种类少是影响微生物肥料发展的重要因素，因而有必要对土壤中的解磷菌进行大规模筛选，并进行系统鉴定，丰富菌种资源，但土壤中的细菌种类极为丰富，通过常规的形态学和生理生化方法难以进行有效的鉴定。笔者所在的实验室在前期研究中获得了8株解磷菌，本研究对这些分离到的解磷菌进行了形态观察及分子鉴定，为丰富解磷微生物菌种资源打下基础。

1 材料与方法

1.1 染色及显微观察

利用革兰氏染色法^[4]对筛选到的高效解磷菌进行染色，将菌液涂布于载玻片上，干燥，固定，结晶紫初染1 min，水洗至无色；碘液媒染1 min，水洗至无色；95%乙醇脱色30 s，水洗至无色；最后沙黄复染1 min，水洗至无色，干燥，镜检。

1.2 细菌总DNA的提取

接种菌株置于LB液体培养基中，于130 r/min下振荡，37 ℃过夜培养。取1.5 mL新鲜菌液于EP管中，于 4 000 r/min 下离心30 s，弃上清，收集菌体；加100 μg/mL 溶菌酶50 μL，于37 ℃下处理1 h辅助裂解；加入预热的CTAB溶液500 μL，充分混合，于65 ℃水浴30 min，混匀；冷却后，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24 ∶1）抽提，颠倒充分混合，10 000 r/min离心10 min；取上清液，加入等体积三氯甲烷/异戊醇（24 ∶1），轻轻颠倒混匀，10 000 r/min离心5 min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀30 min，8 000 r/min离心10 min；弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀2次；在超净工作台上风干DNA，溶于20 μL去离子水中。

1.3 PCR扩增

利用细菌核糖体16S rDNA通用引物27F/1492R^[5]进行PCR反应，其反应体系20 μL，包括10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTP mix 1.6 μL、25 μmol/mL引物27F/1492R各0.4 μL、Taq DNA 聚合酶 1 U、模板DNA 1 μL，去离子水补足至 20 μL。PCR 反应条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 1.5 min，30 次循环；72 ℃ 7 min；4 ℃保温。

1.4 回收及测序

利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，将纯化产物送至大连宝生物公司进行测序。利用BLAST工具在GenBank中对获得的序列进行分析^[6]。经过NCBI比对后下载相关菌株的细菌核糖体16S rDNA序列，所得序列用Clustal X 1.81程序进行多序列比对，并经手工校正；然后用软件MEGA 3.1构建系统发育树。

2 结果与分析

利用PVK平板，从大豆根际土壤中筛选出8株解磷菌，并将这8株解磷菌接种在固体LB培养基上，37 ℃恒温培养条件下菌株的溶磷圈均较大，菌落边缘呈规则的圆形，表面光滑，中心突起，分别编号为北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海伦Ⅰ、海伦Ⅱ、海伦Ⅲ、海伦Ⅳ（部分菌株菌落形态见图1至图4）。由于培养基中加入了溴酚蓝，菌落吸附了染料呈蓝色，但一些菌株具有降解溴酚蓝的能力，如菌株海伦Ⅱ号（图4），蓝色较淡。

革兰氏染色结果显示，海伦Ⅲ号为革兰氏阴性菌，其余均为革兰氏阳性菌。在光学显微镜下可有效观察到菌株的形态（部分菌株形态见图5至图10），其中北安Ⅰ号为链球菌，海伦Ⅱ号、海伦Ⅲ号为球菌，海伦Ⅳ号、北安Ⅲ号为杆菌。

3 结论

利用PVK平板对解磷菌进行分离是一种简单有效的手段^[7]，一些菌株（如芽孢杆菌属）在其生长过程中可产酸，将培养基中的磷酸钙溶解产生溶磷圈，通过分析溶磷圈的大小可对微生物的溶磷能力进行初步估测。本研究中的菌株皆产生了较大的溶磷圈，说明它们可能具有较强的溶磷潜力。本研究获得的解磷菌既有球菌，又有杆菌，但已有研究中分离及初步应用的解磷菌主要是杆菌，因而本研究重点选择了一种杆菌——北安Ⅲ号进行细菌核糖体16S rDNA序列鉴定。结合形态学特点及细菌核糖体16S rDNA序列，确定该菌为巨大芽孢杆菌。该菌是土壤中的重要菌群，对农作物无害，且可能具有一些有益生物学作用，因而该菌株是一种重要的微生物资源，可进一步开发为生物磷肥。

参考文献：

[1]李晓婷. 解磷细菌K3的GFP标记与在土壤中定殖及对玉米生长效应研究[D]. 南京：南京农业大学，2009：1-5.

[2]Gyaneshwar P，Naresh K G，Parekh L J，et al. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants[J]. Plant and Soil，2002，245：83-93.

[3]Rodríguez H，Fraga R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion[J]. Biotechnology Advances，1999，17：319-339.

[4]万翠番，章昭琳，王报贵，等. 高黏附力双歧杆菌的筛选与鉴定[J]. 中国乳品工业，2012（5）：13-15.

[5]Moreno C，Romero J，Romilio T E. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J]. Microbiology，2002，148：1233-1239.

[6]Altschul S F，Madden TL，Chffer A A，et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Res，1997，25（17）：3389-3402.

[7]Kucey R M N，Janzen H H，Legett M E. Microbially mediated increases in plant available phosphorus[J]. Advances in Agronomy，1989，42：199-228.endprint

摘要：利用PVK平板，从大豆根际土壤中分离出8株解磷菌。培养分析结果显示，这8株解磷菌的溶磷圈均较大。其中，海伦Ⅲ号为革兰氏阴性菌，其余均为革兰氏阳性菌。形态学观察结果显示，北安Ⅰ号为链球菌，海伦Ⅱ号、海伦Ⅲ号为球菌，海伦Ⅳ号、北安Ⅲ号为杆菌。基于细菌核糖体16S rDNA序列对北安Ⅲ号菌株进行鉴定，结合形态特征确认该菌株为巨大芽孢杆菌，经研究发现该菌株是一种重要的微生物资源，可进一步开发为生物磷肥。

关键词：解磷菌；溶磷圈；16S rDNA；大豆；生物磷肥

中图分类号：S154.3 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0363-03

土壤中存在一些特定的微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，这些微生物被称为解磷菌，以细菌为主^[1]。将解磷菌作为肥料施入土壤，通过其生长代谢可以在作物根际形成一个磷供应较充分的微区，从而改善作物磷元素的供应，增加作物磷素吸收量，提高作物产量，同时还可以增进土壤肥力、增强植物抗病和抗旱能力^[2]。因此，解磷菌的筛选及鉴定是当前微生物学研究的热点。土壤中解磷微生物种类丰富、数量较多^[2]，目前报道的具有解磷作用的细菌有芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、固氮菌属（Azotobacte）、根瘤菌属（Bradxrkizobium）、硫杆菌属（Thiobacillus）、肠细菌属（Enterbacter）、微球菌属（Microeoccus）、沙门氏菌属（Salmonella）、色杆菌属（Clromobacterium）、产碱菌属（Alcaligenes）、节细菌属（Arthrobacte）、大肠杆菌属（Escherichia）等^[3]。解磷微生物在我国应用较早，有较好的应用前景，但发展不快，应用还不普遍。筛选高效微生物肥料菌株手段单一、菌种种类少是影响微生物肥料发展的重要因素，因而有必要对土壤中的解磷菌进行大规模筛选，并进行系统鉴定，丰富菌种资源，但土壤中的细菌种类极为丰富，通过常规的形态学和生理生化方法难以进行有效的鉴定。笔者所在的实验室在前期研究中获得了8株解磷菌，本研究对这些分离到的解磷菌进行了形态观察及分子鉴定，为丰富解磷微生物菌种资源打下基础。

1 材料与方法

1.1 染色及显微观察

利用革兰氏染色法^[4]对筛选到的高效解磷菌进行染色，将菌液涂布于载玻片上，干燥，固定，结晶紫初染1 min，水洗至无色；碘液媒染1 min，水洗至无色；95%乙醇脱色30 s，水洗至无色；最后沙黄复染1 min，水洗至无色，干燥，镜检。

1.2 细菌总DNA的提取

接种菌株置于LB液体培养基中，于130 r/min下振荡，37 ℃过夜培养。取1.5 mL新鲜菌液于EP管中，于 4 000 r/min 下离心30 s，弃上清，收集菌体；加100 μg/mL 溶菌酶50 μL，于37 ℃下处理1 h辅助裂解；加入预热的CTAB溶液500 μL，充分混合，于65 ℃水浴30 min，混匀；冷却后，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24 ∶1）抽提，颠倒充分混合，10 000 r/min离心10 min；取上清液，加入等体积三氯甲烷/异戊醇（24 ∶1），轻轻颠倒混匀，10 000 r/min离心5 min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀30 min，8 000 r/min离心10 min；弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀2次；在超净工作台上风干DNA，溶于20 μL去离子水中。

1.3 PCR扩增

利用细菌核糖体16S rDNA通用引物27F/1492R^[5]进行PCR反应，其反应体系20 μL，包括10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTP mix 1.6 μL、25 μmol/mL引物27F/1492R各0.4 μL、Taq DNA 聚合酶 1 U、模板DNA 1 μL，去离子水补足至 20 μL。PCR 反应条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 1.5 min，30 次循环；72 ℃ 7 min；4 ℃保温。

1.4 回收及测序

利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，将纯化产物送至大连宝生物公司进行测序。利用BLAST工具在GenBank中对获得的序列进行分析^[6]。经过NCBI比对后下载相关菌株的细菌核糖体16S rDNA序列，所得序列用Clustal X 1.81程序进行多序列比对，并经手工校正；然后用软件MEGA 3.1构建系统发育树。

2 结果与分析

利用PVK平板，从大豆根际土壤中筛选出8株解磷菌，并将这8株解磷菌接种在固体LB培养基上，37 ℃恒温培养条件下菌株的溶磷圈均较大，菌落边缘呈规则的圆形，表面光滑，中心突起，分别编号为北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海伦Ⅰ、海伦Ⅱ、海伦Ⅲ、海伦Ⅳ（部分菌株菌落形态见图1至图4）。由于培养基中加入了溴酚蓝，菌落吸附了染料呈蓝色，但一些菌株具有降解溴酚蓝的能力，如菌株海伦Ⅱ号（图4），蓝色较淡。

革兰氏染色结果显示，海伦Ⅲ号为革兰氏阴性菌，其余均为革兰氏阳性菌。在光学显微镜下可有效观察到菌株的形态（部分菌株形态见图5至图10），其中北安Ⅰ号为链球菌，海伦Ⅱ号、海伦Ⅲ号为球菌，海伦Ⅳ号、北安Ⅲ号为杆菌。

3 结论

利用PVK平板对解磷菌进行分离是一种简单有效的手段^[7]，一些菌株（如芽孢杆菌属）在其生长过程中可产酸，将培养基中的磷酸钙溶解产生溶磷圈，通过分析溶磷圈的大小可对微生物的溶磷能力进行初步估测。本研究中的菌株皆产生了较大的溶磷圈，说明它们可能具有较强的溶磷潜力。本研究获得的解磷菌既有球菌，又有杆菌，但已有研究中分离及初步应用的解磷菌主要是杆菌，因而本研究重点选择了一种杆菌——北安Ⅲ号进行细菌核糖体16S rDNA序列鉴定。结合形态学特点及细菌核糖体16S rDNA序列，确定该菌为巨大芽孢杆菌。该菌是土壤中的重要菌群，对农作物无害，且可能具有一些有益生物学作用，因而该菌株是一种重要的微生物资源，可进一步开发为生物磷肥。

参考文献：

[1]李晓婷. 解磷细菌K3的GFP标记与在土壤中定殖及对玉米生长效应研究[D]. 南京：南京农业大学，2009：1-5.

[2]Gyaneshwar P，Naresh K G，Parekh L J，et al. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants[J]. Plant and Soil，2002，245：83-93.

[3]Rodríguez H，Fraga R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion[J]. Biotechnology Advances，1999，17：319-339.

[4]万翠番，章昭琳，王报贵，等. 高黏附力双歧杆菌的筛选与鉴定[J]. 中国乳品工业，2012（5）：13-15.

[5]Moreno C，Romero J，Romilio T E. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J]. Microbiology，2002，148：1233-1239.

[6]Altschul S F，Madden TL，Chffer A A，et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Res，1997，25（17）：3389-3402.

[7]Kucey R M N，Janzen H H，Legett M E. Microbially mediated increases in plant available phosphorus[J]. Advances in Agronomy，1989，42：199-228.endprint

摘要：利用PVK平板，从大豆根际土壤中分离出8株解磷菌。培养分析结果显示，这8株解磷菌的溶磷圈均较大。其中，海伦Ⅲ号为革兰氏阴性菌，其余均为革兰氏阳性菌。形态学观察结果显示，北安Ⅰ号为链球菌，海伦Ⅱ号、海伦Ⅲ号为球菌，海伦Ⅳ号、北安Ⅲ号为杆菌。基于细菌核糖体16S rDNA序列对北安Ⅲ号菌株进行鉴定，结合形态特征确认该菌株为巨大芽孢杆菌，经研究发现该菌株是一种重要的微生物资源，可进一步开发为生物磷肥。

关键词：解磷菌；溶磷圈；16S rDNA；大豆；生物磷肥

中图分类号：S154.3 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0363-03

土壤中存在一些特定的微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，这些微生物被称为解磷菌，以细菌为主^[1]。将解磷菌作为肥料施入土壤，通过其生长代谢可以在作物根际形成一个磷供应较充分的微区，从而改善作物磷元素的供应，增加作物磷素吸收量，提高作物产量，同时还可以增进土壤肥力、增强植物抗病和抗旱能力^[2]。因此，解磷菌的筛选及鉴定是当前微生物学研究的热点。土壤中解磷微生物种类丰富、数量较多^[2]，目前报道的具有解磷作用的细菌有芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、固氮菌属（Azotobacte）、根瘤菌属（Bradxrkizobium）、硫杆菌属（Thiobacillus）、肠细菌属（Enterbacter）、微球菌属（Microeoccus）、沙门氏菌属（Salmonella）、色杆菌属（Clromobacterium）、产碱菌属（Alcaligenes）、节细菌属（Arthrobacte）、大肠杆菌属（Escherichia）等^[3]。解磷微生物在我国应用较早，有较好的应用前景，但发展不快，应用还不普遍。筛选高效微生物肥料菌株手段单一、菌种种类少是影响微生物肥料发展的重要因素，因而有必要对土壤中的解磷菌进行大规模筛选，并进行系统鉴定，丰富菌种资源，但土壤中的细菌种类极为丰富，通过常规的形态学和生理生化方法难以进行有效的鉴定。笔者所在的实验室在前期研究中获得了8株解磷菌，本研究对这些分离到的解磷菌进行了形态观察及分子鉴定，为丰富解磷微生物菌种资源打下基础。

1 材料与方法

1.1 染色及显微观察

利用革兰氏染色法^[4]对筛选到的高效解磷菌进行染色，将菌液涂布于载玻片上，干燥，固定，结晶紫初染1 min，水洗至无色；碘液媒染1 min，水洗至无色；95%乙醇脱色30 s，水洗至无色；最后沙黄复染1 min，水洗至无色，干燥，镜检。

1.2 细菌总DNA的提取

接种菌株置于LB液体培养基中，于130 r/min下振荡，37 ℃过夜培养。取1.5 mL新鲜菌液于EP管中，于 4 000 r/min 下离心30 s，弃上清，收集菌体；加100 μg/mL 溶菌酶50 μL，于37 ℃下处理1 h辅助裂解；加入预热的CTAB溶液500 μL，充分混合，于65 ℃水浴30 min，混匀；冷却后，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24 ∶1）抽提，颠倒充分混合，10 000 r/min离心10 min；取上清液，加入等体积三氯甲烷/异戊醇（24 ∶1），轻轻颠倒混匀，10 000 r/min离心5 min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀30 min，8 000 r/min离心10 min；弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀2次；在超净工作台上风干DNA，溶于20 μL去离子水中。

1.3 PCR扩增

利用细菌核糖体16S rDNA通用引物27F/1492R^[5]进行PCR反应，其反应体系20 μL，包括10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTP mix 1.6 μL、25 μmol/mL引物27F/1492R各0.4 μL、Taq DNA 聚合酶 1 U、模板DNA 1 μL，去离子水补足至 20 μL。PCR 反应条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 1.5 min，30 次循环；72 ℃ 7 min；4 ℃保温。

1.4 回收及测序

利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，将纯化产物送至大连宝生物公司进行测序。利用BLAST工具在GenBank中对获得的序列进行分析^[6]。经过NCBI比对后下载相关菌株的细菌核糖体16S rDNA序列，所得序列用Clustal X 1.81程序进行多序列比对，并经手工校正；然后用软件MEGA 3.1构建系统发育树。

2 结果与分析

利用PVK平板，从大豆根际土壤中筛选出8株解磷菌，并将这8株解磷菌接种在固体LB培养基上，37 ℃恒温培养条件下菌株的溶磷圈均较大，菌落边缘呈规则的圆形，表面光滑，中心突起，分别编号为北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海伦Ⅰ、海伦Ⅱ、海伦Ⅲ、海伦Ⅳ（部分菌株菌落形态见图1至图4）。由于培养基中加入了溴酚蓝，菌落吸附了染料呈蓝色，但一些菌株具有降解溴酚蓝的能力，如菌株海伦Ⅱ号（图4），蓝色较淡。

革兰氏染色结果显示，海伦Ⅲ号为革兰氏阴性菌，其余均为革兰氏阳性菌。在光学显微镜下可有效观察到菌株的形态（部分菌株形态见图5至图10），其中北安Ⅰ号为链球菌，海伦Ⅱ号、海伦Ⅲ号为球菌，海伦Ⅳ号、北安Ⅲ号为杆菌。

3 结论

利用PVK平板对解磷菌进行分离是一种简单有效的手段^[7]，一些菌株（如芽孢杆菌属）在其生长过程中可产酸，将培养基中的磷酸钙溶解产生溶磷圈，通过分析溶磷圈的大小可对微生物的溶磷能力进行初步估测。本研究中的菌株皆产生了较大的溶磷圈，说明它们可能具有较强的溶磷潜力。本研究获得的解磷菌既有球菌，又有杆菌，但已有研究中分离及初步应用的解磷菌主要是杆菌，因而本研究重点选择了一种杆菌——北安Ⅲ号进行细菌核糖体16S rDNA序列鉴定。结合形态学特点及细菌核糖体16S rDNA序列，确定该菌为巨大芽孢杆菌。该菌是土壤中的重要菌群，对农作物无害，且可能具有一些有益生物学作用，因而该菌株是一种重要的微生物资源，可进一步开发为生物磷肥。

参考文献：

[1]李晓婷. 解磷细菌K3的GFP标记与在土壤中定殖及对玉米生长效应研究[D]. 南京：南京农业大学，2009：1-5.

[2]Gyaneshwar P，Naresh K G，Parekh L J，et al. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants[J]. Plant and Soil，2002，245：83-93.

[3]Rodríguez H，Fraga R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion[J]. Biotechnology Advances，1999，17：319-339.

[4]万翠番，章昭琳，王报贵，等. 高黏附力双歧杆菌的筛选与鉴定[J]. 中国乳品工业，2012（5）：13-15.

[5]Moreno C，Romero J，Romilio T E. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J]. Microbiology，2002，148：1233-1239.

[6]Altschul S F，Madden TL，Chffer A A，et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Res，1997，25（17）：3389-3402.

[7]Kucey R M N，Janzen H H，Legett M E. Microbially mediated increases in plant available phosphorus[J]. Advances in Agronomy，1989，42：199-228.endprint