土壤中抗生素残留对土壤微生物活性与功能的影响

袁德梽

摘要：通过研究抗生素残留对土壤呼吸以及氨化的作用，以探讨抗生素对土壤微生物活性与功能的影响。结果表明，3种抗生素残留对土壤呼吸有不同程度的抑制作用，最大抑制率为15%，并且随着时间延长和浓度升高，呼吸抑制效果更加明显。抗生素残留对土壤氨化起抑制作用，土壤铵态氮含量呈先增加后降低再增加的趋势，处理3 d后土壤铵态氮含量最高，抑制率在90%～99%。由此可见，土壤抗生素残留对土壤微生物活性功能有很大影响，对土壤抗生素的生态毒理性研究很有必要。

关键词：抗生素；土壤；微生物活性；呼吸；氨化

中图分类号：S154.3 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0319-03

抗生素是世界上用量最大、使用最广泛的药物之一。全球抗生素年均使用总量为10万～20万t，我国每年有成千上万吨的抗生素类药物被用于畜禽养殖。含有残留兽药的粪便作为有机肥施入农田，造成土壤污染，对人类健康和生态系统产生潜在危害。养殖业使用的主要兽药种类为抗生素类药物，且用量逐年增加，目前土壤中兽药残留浓度范围为 μg/kg 级到g/kg级。本试验在总结国内外相关研究的基础上，重点研究抗生素残留对土壤微生物群落功能和结构的影响^[1]。

1 材料与方法

1.1 抗生素标准样品

本试验主要针对4种抗生素进行研究，分别是四环素类四环素（tetracycline，纯度为98%）、金霉素（CTC，纯度为95%），喹诺酮类诺氟沙星（BR，纯度为99%），以上均产自上海卒瑞生物科技有限公司；喹诺酮类环丙沙星（Ciprofloxacin hydrochloride，98%），产自阿拉丁试剂有限公司。

1.2 抗生素标准溶液配制

2 000 μg/mL标准溶液：取100 mg抗生素加入蒸馏水中，并定容至50 mL。取1.25 mL标准溶液定容至25 mL，配制浓度为1 μg/g；量取6.25 mL标准溶液定容至25 mL，配制浓度为5 μg/g；取12.5 mL标准溶液定容至25mL，配制浓度为10 μg/g。

1.3 氨化培养基的配制

（1）液体培养基：取磷酸氢二钾0.5 g，氯化钠1 g，七水合硫酸镁0.25 g，硫酸亚铁0.2 g，葡萄糖2.5 g，硫酸铵1.0 g，加入水中，并定容至500 mL，调节pH值至7.2～7.4，在灭菌锅中120 ℃灭菌30 min。

（2）0.2%蛋白胨：将1 g蛋白胨粉末加入水中，并定容至500 mL，在灭菌锅中120 ℃灭菌30 min。

1.4 抗生素污染土壤配制与模拟

1.4.1 供试土壤及前处理

试验土壤采集于重庆三峡职业学院校园内，将采集后的土壤过20目筛，去除杂质，并风干 1 d，常温保存。

1.4.2 土壤含水率的选择与确定

经测定原土壤含水率约为10%，取土样80 g即含8 g水、72 g干土。在80 g土壤中分别加入10、15、21、29 mL水，使其含水率分别为15%、20%、30%、40%。

1.5 土壤呼吸作用的测定

测定土壤微生物呼吸最常用的方法是直接吸收法，具体的试验步骤为：称50 g的供试土壤放在100 mL的广口瓶中，共20份，然后向土壤中添加4种抗生素，分别是四环素、金霉素、诺氟沙星和环丙沙星，并且保证4种抗生素的浓度均为0、1、5、25、50 mg/kg等5个处理，其中0 mg/kg处理作为对照，同时5个处理均设1个重复。同时将盛放有5 mL的0.1 mol/L氢氧化钠溶液的小玻璃瓶放在一个密闭容器的底部，然后将广口玻璃瓶进行密封。将密封好的广口玻璃瓶放入恒温为 25 ℃ 的人工培养箱中1、3、5、7、9、11 d，在盛有氢氧化钠的高型烧杯中加入1 mL的1 mol/L氯化钡溶液，另外加入2～3滴酚酞试剂，以起到指示剂的作用，运用0.05 mol/L盐酸滴定来观察酚酞的变化，并记录盐酸的消耗量，同时换盛有新鲜氢氧化钠溶液的小玻璃瓶^[2]。

1.6 土壤氨化作用的测定

测定土壤氨化作用的具体步骤为：先取5支500 mL的三角瓶，称取100 g的供试土壤分别放入每支三角瓶中，然后加入5 mL用于灭菌的浓度为0.2%蛋白胨以及2 mL的氨化菌液体培养基，并分别加入四环素、金霉素、诺氟沙星，使其终浓度分别为0（CK）、1、5、10、20 μg/g土，最终土 ∶水=3 ∶1。把上述5支三角瓶均塞上棉塞后放入恒温为28 ℃的培养箱。然后进行康维皿扩散试验：首先从三角瓶中称取土壤20 g，向土壤中加入80 mL的1 mol/L氯化钾溶液，将加入溶液的土壤振荡浸提1 h后进行过滤，过滤后吸取滤液4 mL放在康维皿外室，在中心小室加入0.1 mol/L硫酸 2 mL。盖上皿盖，留1个小孔，然后快速用滴管从小孔中加入40%氢氧化钠溶液1 mL。盖紧瓶盖后，将康维皿进行摇动，然后放入温度为 40 ℃ 的恒温箱4 h，将10 mL的蒸馏水滴入中心小室，然后分4次将溶液转移到50 mL的容量瓶中。钠氏试剂显色的方法与铵态氮标准曲线的绘制有异曲同工之妙，对照标准曲线每3 d测定1次，一共需要测定6次^[3]。

1.7 铵态氮标准曲线的绘制方法

取6支25 mL的容量瓶，分别放入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的铵态氮标准溶液，然后以蒸馏水进行稀释，稀释到10 mL，在溶液中再分别加入0.8 mL的钠氏试剂并将溶液摇匀。向每个容量瓶中缓慢加入4 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液，待钠氏试剂显色后稀释至刻度。10 min过后，在分光光度计上波长460 nm的地方测定其吸光度。在绘制曲线时以铵态氮浓度为纵坐标，以吸光度为横坐标。endprint

2 结果与分析

2.1 抗生素残留对土壤呼吸作用的影响

由图1可知，4种不同浓度的四环素残留对土壤呼吸均表现为抑制作用，并且抗生素残留浓度越大，抑制水平相对越高。同时，四环素残留在土壤中总体表现前9 d抑制能力较弱，9 d后抑制能力较强，11 d后对土壤呼吸作用的抑制作用最强，抑制率在5%～15%。

3 结论

4种不同浓度的抗生素残留对土壤呼吸作用基本表现出抑制作用，并且抗生素残留浓度越大，抑制水平相对越高。同时，抗生素残留在土壤中总体表现前 7 d抑制能力较弱， 7 d后土壤呼吸抑制能力较强。并且土壤中抗生素添加浓度越大，其对土壤呼吸抑制作用就越强，抑制效果越明显。其中，四环素对土壤呼吸主要起到抑制的作用；金霉素在处理后的处理1、7 d表现为激活作用，但是其他时间对土壤呼吸作用均起抑制作用；诺氟沙星在浓度较低时对土壤呼吸作用起到抑制作用，但在浓度较高时对土壤呼吸作用起到激活作用，在进行处理15 d后，所有经过处理的微生物呼吸作用都基本上恢复到了对照水平，表明微生物对其能够产生适应性^[4]。

抗生素残留对土壤氨化在1～3 d内促进作用明显，3 d以后铵态氮含量逐渐减少。四环素和金霉素残留对土壤氨化有刺激作用，而诺氟沙星残留则会对其起抑制作用。6 d后四环素和诺氟沙星残留对土壤氨化有一定的刺激作用，金霉素残留会抑制土壤的氨化作用。四环素残留对土壤氨化作用有刺激作用，而诺氟沙星和金霉素残留则会对其起抑制作用。土壤氨化作用强度与土壤的供氮能力在一定程度上有很大关系。因此，如果土壤中抗生素残留一直保持较高浓度，会大大影响土壤的供氮能力^[5]。

参考文献：

[1]王金花，朱鲁生，王 军，等. 4种典型抗生素对土壤微生物呼吸的影响[J]. 农业环境科学学报，2011，30（11）：2232-2236.

[2]Beyer L. Intersite characterization and variability of soil respiration in different arable and forest soils[J]. Biology and Fertility of Soils，1991，12：122-126.

[3]Buyanovsky G A，Wagner G H，Gantzer C J. Soil respiration in a winter wheat ecosystem[J]. Soil Science Society of America Journal，1986，50：338-344.

[4]Zelles L，Bahig M E. Measurement of bioactivity based on CO2-released and ATP content in soil after different treatments[J]. Chemosphere，1984，13（8）：899-913.

[5]Zhu L S，Zhang Y F，Fan D F，et al. Study on the effects of phoxim，fenpropathrin and its mixture on respiration of soil microbe[J]. A Groenvironmental Protection，1999，18（1）：25-27.endprint

2 结果与分析

2.1 抗生素残留对土壤呼吸作用的影响

由图1可知，4种不同浓度的四环素残留对土壤呼吸均表现为抑制作用，并且抗生素残留浓度越大，抑制水平相对越高。同时，四环素残留在土壤中总体表现前9 d抑制能力较弱，9 d后抑制能力较强，11 d后对土壤呼吸作用的抑制作用最强，抑制率在5%～15%。

3 结论

4种不同浓度的抗生素残留对土壤呼吸作用基本表现出抑制作用，并且抗生素残留浓度越大，抑制水平相对越高。同时，抗生素残留在土壤中总体表现前 7 d抑制能力较弱， 7 d后土壤呼吸抑制能力较强。并且土壤中抗生素添加浓度越大，其对土壤呼吸抑制作用就越强，抑制效果越明显。其中，四环素对土壤呼吸主要起到抑制的作用；金霉素在处理后的处理1、7 d表现为激活作用，但是其他时间对土壤呼吸作用均起抑制作用；诺氟沙星在浓度较低时对土壤呼吸作用起到抑制作用，但在浓度较高时对土壤呼吸作用起到激活作用，在进行处理15 d后，所有经过处理的微生物呼吸作用都基本上恢复到了对照水平，表明微生物对其能够产生适应性^[4]。

抗生素残留对土壤氨化在1～3 d内促进作用明显，3 d以后铵态氮含量逐渐减少。四环素和金霉素残留对土壤氨化有刺激作用，而诺氟沙星残留则会对其起抑制作用。6 d后四环素和诺氟沙星残留对土壤氨化有一定的刺激作用，金霉素残留会抑制土壤的氨化作用。四环素残留对土壤氨化作用有刺激作用，而诺氟沙星和金霉素残留则会对其起抑制作用。土壤氨化作用强度与土壤的供氮能力在一定程度上有很大关系。因此，如果土壤中抗生素残留一直保持较高浓度，会大大影响土壤的供氮能力^[5]。

参考文献：

[1]王金花，朱鲁生，王 军，等. 4种典型抗生素对土壤微生物呼吸的影响[J]. 农业环境科学学报，2011，30（11）：2232-2236.

[2]Beyer L. Intersite characterization and variability of soil respiration in different arable and forest soils[J]. Biology and Fertility of Soils，1991，12：122-126.

[3]Buyanovsky G A，Wagner G H，Gantzer C J. Soil respiration in a winter wheat ecosystem[J]. Soil Science Society of America Journal，1986，50：338-344.

[4]Zelles L，Bahig M E. Measurement of bioactivity based on CO2-released and ATP content in soil after different treatments[J]. Chemosphere，1984，13（8）：899-913.

[5]Zhu L S，Zhang Y F，Fan D F，et al. Study on the effects of phoxim，fenpropathrin and its mixture on respiration of soil microbe[J]. A Groenvironmental Protection，1999，18（1）：25-27.endprint

2 结果与分析

2.1 抗生素残留对土壤呼吸作用的影响

由图1可知，4种不同浓度的四环素残留对土壤呼吸均表现为抑制作用，并且抗生素残留浓度越大，抑制水平相对越高。同时，四环素残留在土壤中总体表现前9 d抑制能力较弱，9 d后抑制能力较强，11 d后对土壤呼吸作用的抑制作用最强，抑制率在5%～15%。

3 结论

4种不同浓度的抗生素残留对土壤呼吸作用基本表现出抑制作用，并且抗生素残留浓度越大，抑制水平相对越高。同时，抗生素残留在土壤中总体表现前 7 d抑制能力较弱， 7 d后土壤呼吸抑制能力较强。并且土壤中抗生素添加浓度越大，其对土壤呼吸抑制作用就越强，抑制效果越明显。其中，四环素对土壤呼吸主要起到抑制的作用；金霉素在处理后的处理1、7 d表现为激活作用，但是其他时间对土壤呼吸作用均起抑制作用；诺氟沙星在浓度较低时对土壤呼吸作用起到抑制作用，但在浓度较高时对土壤呼吸作用起到激活作用，在进行处理15 d后，所有经过处理的微生物呼吸作用都基本上恢复到了对照水平，表明微生物对其能够产生适应性^[4]。

抗生素残留对土壤氨化在1～3 d内促进作用明显，3 d以后铵态氮含量逐渐减少。四环素和金霉素残留对土壤氨化有刺激作用，而诺氟沙星残留则会对其起抑制作用。6 d后四环素和诺氟沙星残留对土壤氨化有一定的刺激作用，金霉素残留会抑制土壤的氨化作用。四环素残留对土壤氨化作用有刺激作用，而诺氟沙星和金霉素残留则会对其起抑制作用。土壤氨化作用强度与土壤的供氮能力在一定程度上有很大关系。因此，如果土壤中抗生素残留一直保持较高浓度，会大大影响土壤的供氮能力^[5]。

参考文献：

[1]王金花，朱鲁生，王 军，等. 4种典型抗生素对土壤微生物呼吸的影响[J]. 农业环境科学学报，2011，30（11）：2232-2236.

[2]Beyer L. Intersite characterization and variability of soil respiration in different arable and forest soils[J]. Biology and Fertility of Soils，1991，12：122-126.

[3]Buyanovsky G A，Wagner G H，Gantzer C J. Soil respiration in a winter wheat ecosystem[J]. Soil Science Society of America Journal，1986，50：338-344.

[4]Zelles L，Bahig M E. Measurement of bioactivity based on CO2-released and ATP content in soil after different treatments[J]. Chemosphere，1984，13（8）：899-913.

[5]Zhu L S，Zhang Y F，Fan D F，et al. Study on the effects of phoxim，fenpropathrin and its mixture on respiration of soil microbe[J]. A Groenvironmental Protection，1999，18（1）：25-27.endprint