毛冬青根提取液不同部位的血小板聚集抑制活性

林丽萍+李英+吕晔

摘要：采用萃取和柱层析法制备毛冬青各提取部位；用Born比浊法，以ADP为诱导剂检测毛冬青根提取液各部位对血小板聚集的抑制率，从而确定毛冬青根抗血小板聚集的有效部位。结果表明，各部位均具有不同程度的抑制效果。其中水部位和D101-95%乙醇部位活性最强，且在0.08～0.5 mg/mL范围内，随着剂量的增加，其活性也随之加强，抗血小板聚集活性与剂量呈正相关。

关键词：毛冬青；提取部位；抗血小板聚集

中图分类号：R285 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0289-02

毛冬青为冬青科（Aquffoliaceae）冬青属植物毛冬青（Ilex pubescens Hook.et Am.）的干燥根，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒之功效。已有研究结果表明毛冬青制剂有扩张血管及抗菌消炎的作用，临床用于冠状动脉硬化性心脏病，血栓闭塞性脉管炎，并用于中心性视网膜炎，小儿肺炎等疾病的治疗，有显著疗效^[1]。查阅大量文献可知，当前报道的毛冬青中具有抗血小板聚集活性的单体化合物有毛冬青甲素^[2]、毛冬青酸^[3-4]、Ilexosides D^[5]、Ilexosides J^[6]、Ilexgenin A、缩醛基毛冬青化合物R4^[7]、Pubescenosides A和Pubescenosides B^[8]8种。此外，笔者以Ilexgenin A为先导化合物进行结构修饰，也得到了一系列具有抗血小板聚集活性的衍生物^[9]。然而，究竟毛冬青根提取液中哪个部位抗血小板聚集活性高，前人没有做过详细的研究。本研究利用萃取和柱层析的方法，获得毛冬青根提取液的不同极性部位，以ADP为诱导剂，测定它们对血小板聚集的抑制效果，为后续有效成分的分离纯化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物

新西兰大耳白兔♀兼用，体质量1.7～2.0 kg，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。

1.2 药物与试剂

毛冬青于2012年采自广西，经广西药用植物园韦发南研究员鉴定为毛冬青科冬青属植物毛冬青（Ilex pubescens Hook.et Am.）的干燥根，留样样品保存在本所标本馆；柱层析硅胶和薄层层析硅胶（青岛海洋化工有限公司产品）；阿司匹林（Sigma，货号：A2093）；甲醇、正丁醇、二氯甲烷、乙醇、DMSO均为国产分析纯（上海实意化学试剂有限公司产品）。

1.3 仪器

普通层析柱，超声仪，型号KQ2200B，昆明市超声仪器有限公司产品；低温离心机，型号1-15K，Sigma Corporation公司产品；血小板聚集仪，型号LBY-NJ，北京普利生仪器有限公司产品。

1.4 毛冬青提取液各部位的制备

将毛冬青根原材料粉碎后，70%乙醇回流提取3次，每次3 h，提取液浓缩得浸膏。浸膏水溶（1 kg ∶2 L）超声悬浮得水悬浮液，依次用石油醚和水饱和的正丁醇萃取，得正丁醇部位和水部位。正丁醇部位减压旋蒸、水浴蒸干，甲醇溶解上D101大孔树脂柱，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇冲柱，得D101-水部位、D101-30%乙醇部位、D101-50%乙醇部位、D101-70%乙醇部位和D101-95%乙醇部位。取各部位分别浓缩蒸干后各取粉末5 mg，以0.5% DMSO作为溶媒，各部位分别配置0.08、0.20，0.50 mg/mL 3个浓度备用。

1.5 血小板聚集率测定

1.5.1 血浆样品的制备

取健康新西兰大耳白兔，静脉注射20%乌拉坦1 g/kg 麻醉，颈总动脉取血，以3.8%枸橼酸钠抗凝（血与抗凝剂体积比为9 ∶1）。室温下1 000 r/min离心 15 min，吸取上层富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP），剩余血液3 000 r/min 离心15 min，吸取上清液贫血小板血浆（platelet poor plasma，PPP）。制备好的PRP应在3 h内用完。

1.5.2 体外抗血小板聚集试验

取新西兰大耳白兔，按“1.5.1”节方法制备PRP和PPP。用PPP调整PRP中血小板数为（3～4）×1011个/L。以0.5% DMSO作为溶媒对照，测定时以PPP调零。精密吸取15 μL溶媒或药物溶液加入到270 μL PRP中，在37 ℃比浊杯内孵育5 min，用PPP调零，再加入诱导剂 ADP 溶液15 μL（终浓度为10 μmol/L），按Born比浊法测定血小板聚集率，记录5 min内最大聚集率。血小板聚集抑制率=（对照组最大聚集率-药物组最大聚集率）/对照组最大聚集率×100%。

1.5.3 统计学方法

所有试验数据均以“x±s”表示，采用SPSS 18.0进行t检验。

2 结果

与对照组相比，D101-70%乙醇部位0.2 mg/mL和 0.5 mg/mL 均显著抑制ADP诱导的新西兰大耳白兔血小板聚集（P<0.05），毛冬青浸膏、水部位、正丁醇部位、D101-水部位、D101-50%乙醇部位和D101-95%乙醇部位均极显著抑制ADP诱导的新西兰大耳白兔血小板聚集（P<0.01）（表1）。

3 讨论

毛冬青是我国常用中药之一，临床应用广泛，在治疗血栓方面表现出较好的疗效。本试验结果表明，毛冬青具有显著抗血小板聚集的活性，毛冬青浸膏、水部位、正丁醇部位、D101-水部位、D101-50%乙醇部位和D101-95%乙醇部位，均可极显著地抑制血小板聚集，且呈剂量依赖关系；在 0.5 mg/mL 时，其抑制作用强度也均高于阳性对照药阿司匹林。在本次试验剂量范围内，水部位、D101-50%乙醇部位和D101-95%乙醇部位在抗血小板聚集方面较为显著，因此可判定其抗血小板聚集的有效部位是水部位、D101-50%乙醇部位和D101-95%乙醇部位。下一步试验需对具有抗血小板聚集作用的有效部位进一步分析，以期分离纯化有效成分和探索其药理作用。endprint

参考文献：

[1]南京中医药大学. 中药大辞典[M]. 上海：上海人民出版社，2006：617-618.

[2]汪 钟，杜金香，朱国强，等. 毛冬青甲素对血小板功能和形态的影响[J]. 中西医结合杂志，1985，5（4）：232-234.

[3]张芳林. 毛冬青酸抗血栓实验研究及机制探讨[J]. 江西医学院学报，2003，43（2）：33-37.

[4]Li M，Wu W K，Liu L，et al. Specific inhibiting effects of liexonin Aon von Widebrand factor-dependent platelet aggregation under high shear rate[J]. Chin Med J，2004，117（2）：241-246.

[5]Lee C K，Lee H S，Huh M D，et al. Anticoagulant activity of ilexoside D，a triterpeniod saponin from Iles pubescens[J]. Arch of Pharm Res，1993，16（3）：209-212.

[6]Han Y N，Baik S K，Kim T H，et al. Antithrombotic activities of saponins from Ilex pubescens[J]. Arch Pharm Res，1987，10（2）：115-120.

[7]付晓春，徐 哲，陈建军. 缩醛基毛冬青化合物R4的抗血栓作用研究[J]. 现代中西医结合杂志，2011，20（34）：4335-4336，4456.

[8]Jiang Z H，Wang J R，Li M. Hemiterpene glucosides with anti-platele aggregation activities from Ilex pubescens[J]. J Nat Prod，2005，68（3）：397.

[9]Lin L P，Wu F H，Liang J Y. The first examples of ilexgenin A hybrids as a new class of multi-potent，anti-platelet agents[J]. Chin Chem Lett，2013，24（8）：723-726.endprint

参考文献：

[1]南京中医药大学. 中药大辞典[M]. 上海：上海人民出版社，2006：617-618.

[2]汪 钟，杜金香，朱国强，等. 毛冬青甲素对血小板功能和形态的影响[J]. 中西医结合杂志，1985，5（4）：232-234.

[3]张芳林. 毛冬青酸抗血栓实验研究及机制探讨[J]. 江西医学院学报，2003，43（2）：33-37.

[4]Li M，Wu W K，Liu L，et al. Specific inhibiting effects of liexonin Aon von Widebrand factor-dependent platelet aggregation under high shear rate[J]. Chin Med J，2004，117（2）：241-246.

[5]Lee C K，Lee H S，Huh M D，et al. Anticoagulant activity of ilexoside D，a triterpeniod saponin from Iles pubescens[J]. Arch of Pharm Res，1993，16（3）：209-212.

[6]Han Y N，Baik S K，Kim T H，et al. Antithrombotic activities of saponins from Ilex pubescens[J]. Arch Pharm Res，1987，10（2）：115-120.

[7]付晓春，徐 哲，陈建军. 缩醛基毛冬青化合物R4的抗血栓作用研究[J]. 现代中西医结合杂志，2011，20（34）：4335-4336，4456.

[8]Jiang Z H，Wang J R，Li M. Hemiterpene glucosides with anti-platele aggregation activities from Ilex pubescens[J]. J Nat Prod，2005，68（3）：397.

[9]Lin L P，Wu F H，Liang J Y. The first examples of ilexgenin A hybrids as a new class of multi-potent，anti-platelet agents[J]. Chin Chem Lett，2013，24（8）：723-726.endprint

参考文献：

[1]南京中医药大学. 中药大辞典[M]. 上海：上海人民出版社，2006：617-618.

[2]汪 钟，杜金香，朱国强，等. 毛冬青甲素对血小板功能和形态的影响[J]. 中西医结合杂志，1985，5（4）：232-234.

[3]张芳林. 毛冬青酸抗血栓实验研究及机制探讨[J]. 江西医学院学报，2003，43（2）：33-37.

[4]Li M，Wu W K，Liu L，et al. Specific inhibiting effects of liexonin Aon von Widebrand factor-dependent platelet aggregation under high shear rate[J]. Chin Med J，2004，117（2）：241-246.

[5]Lee C K，Lee H S，Huh M D，et al. Anticoagulant activity of ilexoside D，a triterpeniod saponin from Iles pubescens[J]. Arch of Pharm Res，1993，16（3）：209-212.

[6]Han Y N，Baik S K，Kim T H，et al. Antithrombotic activities of saponins from Ilex pubescens[J]. Arch Pharm Res，1987，10（2）：115-120.

[7]付晓春，徐 哲，陈建军. 缩醛基毛冬青化合物R4的抗血栓作用研究[J]. 现代中西医结合杂志，2011，20（34）：4335-4336，4456.

[8]Jiang Z H，Wang J R，Li M. Hemiterpene glucosides with anti-platele aggregation activities from Ilex pubescens[J]. J Nat Prod，2005，68（3）：397.

[9]Lin L P，Wu F H，Liang J Y. The first examples of ilexgenin A hybrids as a new class of multi-potent，anti-platelet agents[J]. Chin Chem Lett，2013，24（8）：723-726.endprint