液体发酵法发酵豆粕产蛋白酶条件的优化

王伟+王世英+朱宝成

摘要：为了提高B-15菌株发酵豆粕产蛋白酶能力，采用单因素法对 B-15菌株发酵培养基所需的碳源、氮源、无机盐进行筛选，采用正交试验对B-15菌株的发酵培养基组成及发酵培养条件进行优化，最终确定最适发酵培养基组成为葡萄糖为2%、豆粕浓度为12%、KCl为0.01%、MgSO4为0.05%。通过发酵工艺条件参数的正交优化试验得出发酵培养基的最佳工艺参数为：发酵时间为48 h，装瓶量为50 mL，种龄为14 h，pH值为6.5。在此条件下B-15菌株发酵产蛋白酶活力为125.05 U/mL，与基础发酵培养基相比，提高了11.9%。

关键词：液体发酵；发酵条件；正交优化；蛋白酶活力

中图分类号：TQ920.1 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0273-03

大豆肽是一种比大豆蛋白质更为优质、新型的大豆蛋白酶改性产品，广泛应用于发酵、制药、食品、化妆品、饲料及植物营养剂等行业^[1-3]。大豆肽易消化吸收，能迅速供给机体能量，无蛋白变性，无豆腥味，液体黏性小和受热不凝固等，并具有降低血清胆固醇^[4]、降低血压、抗疲劳^[5]、抗氧化^[6]等许多生物功能，因此大豆肽成为研究热点。目前，大豆肽多采用酶解法和微生物发酵法生产^[7]，微生物发酵法把蛋白酶的发酵生产和大豆肽的酶解生产有机结合在一起，降低了大豆肽功能的生产成本，克服了酶水解法制备大豆肽产品的苦味大和口感差等缺点^[8]。目前，利用微生物发酵法生产大豆肽被认为是较先进有效方法，应用前景较好。本试验以蛋白酶活力为指标，通过单因素和正交试验对产蛋白酶芽孢杆菌 B-15 发酵处理豆粕的产酶培养基组成、发酵工艺条件进行了优化，以确定最佳的豆粕发酵产酶工艺，为大豆肽的大规模液态发酵生产奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 细菌菌株：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B-15，由河北农业大学生命科学学院制药工程实验室分离并保存。

1.1.2 培养基 NA培养基、NB培养基的配制详见文献[9]。种子培养基即NB培养基；基础发酵培养基：豆粕10%、Na2HPO4 0.84%、KH2PO4 0.032%、CaCl2 0.17%、混匀后调pH值6.0～6.5。

1.1.3 试剂

福林-酚试剂；0.55 mol/L 碳酸钠溶液、10% 三氯醋酸溶液、0.02 mol/L pH值7.5磷酸缓冲液、1%酪蛋白溶液、100 μg/mL标准酪氨酸溶液，所用试剂皆为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的培养与发酵

1.2.1.1 摇瓶种子曲线（生长曲线）及种子培养

将斜面培养的菌株接种于NB培养基中，250 mL三角瓶中的装瓶量为75 mL（250 mL，下同），在37 ℃下180 r/min振荡培养，在零时开始取样，以后每隔1 h或2 h取样1次，直至培养24 h为止，以未接菌的培养基作空白调零，用分光光度计在600 nm下测D，以发酵时间为x轴、以D为y轴作曲线，绘制生长曲线。将斜面培养的菌株接种于NB培养基中，装瓶量为 75 mL，180 r/min摇床培养，培养时间由生长曲线确定，得到种子液。

1.2.1.2 发酵培养

对培养基成分采用以下的培养条件进行优化：将种子液以2%的接种量接入75 mL/250 mL三角瓶发酵培养基中，于37 ℃、180 r/min下振荡培养48 h，将发酵液在5 000 r/min条件下离心10 min，弃去沉淀，收集上清液，进行蛋白酶活力测定。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 不同碳源

分别以2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米淀粉、D-果糖等7种碳源进行B-15菌株产酶活力比较试验，配制7种碳源不同的发酵培养基，均加入10%氮源豆粕，0.84% Na2HPO4，0.032% KH2PO4，0.17% CaCl2，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适碳源。

1.2.2.2 不同氮源浓度

配制豆粕浓度分别为2%、5%、8%、11%、14%的培养基发酵培养，进行B-15菌株产酶活力比较试验，均加入2%最适碳源，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4、0.17% CaCl2，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适氮源浓度。

1.2.2.3 不同无机盐

以浓度为0.05%的CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnCl2、KCl、NaCl、ZnCl2等7种供试无机盐进行B-15菌株产酶活力比较试验，配制7种无机盐不同的发酵培养基，均加入2%最适碳源，最适氮源浓度的豆粕，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适2种无机盐。

1.2.3 正交试验

1.2.3.1 培养基组分

在培养基各组分初步筛选的基础上，研究培养基成分的不同配比对酶活力的影响。选用L16（44）设计方案设计4因素4水平正交试验（表1），根据上述试验确定的最适碳源、氮源、无机盐配制不同组成的培养基，测定发酵菌株产酶活力。综合正交试验结果，初步确定最佳组合，得出B-15菌株产酶的最佳培养基组成。

肽发酵培养基最佳组成，即葡萄糖为2%，豆粕浓度为12%，KCl为0.01%，MgSO4为0.05%。通过对其进行发酵工艺条件参数的正交优化试验得出发酵培养基的最佳工艺参数，即发酵时间为48 h，装瓶量为50 mL，种龄为14 h，pH值为6.5。在此条件下，B-15菌株发酵产蛋白酶活力为125.05 U/mL，与基础发酵培养基相比提高了11.9%，研究结果为进一步利用豆粕提供了理论依据。

参考文献：

[1]豆康宁，董 彬，王银满. 大豆蛋白活性肽的生物功能与应用前景[J]. 粮食加工，2007，32（2）：52-54.

[2]邓成萍，张 惠，魏秀英.大豆低聚肽的研究进展[J]. 食品科学，2004，25（增刊）：236-240.

[3]王 静，郝再彬. 大豆肽的特性和功能及研究进展[J]. 黑龙江农业科学，2004（5）：32-36.

[4]宋俊梅，曲静然，徐少萍. 大豆肽的研究进展（待续）[J]. 山东轻工业学院学报，2002，16（3）：1-3.

[5]郑哲君，李晓莉，王 朔. 抗疲劳功能食品的研究进展[J]. 食品科技，2006，31（2）：4-7.

[6]Chen H M，Muramoto K，Yamauchi F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. Agric and Food Chem，1995，43（5）：574-578.

[7]方海红，胡好远，黄红英，等. 微生物碱性蛋白酶的研究进展[J]. 微生物学通报，2002，29（2）：57-59.

[8]邓 勇，吴煜欢. 微生物蛋白酶对大豆分离蛋白水解作用的研究[J]. 食品科学，1999，20（6）：42-45.

[9]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：351.

[10]Iemura Y，Yamada T，Takahashi T，et al. Properties of the peptides liberated from rice protein in sokujo-moto[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，1999，88（3）：276-280.

[11]李志忠，袁惠君，张丙云，等. 大豆多肽的功能与开发研究[J]. 甘肃科技，2006，22（4）：179-181.endprint

摘要：为了提高B-15菌株发酵豆粕产蛋白酶能力，采用单因素法对 B-15菌株发酵培养基所需的碳源、氮源、无机盐进行筛选，采用正交试验对B-15菌株的发酵培养基组成及发酵培养条件进行优化，最终确定最适发酵培养基组成为葡萄糖为2%、豆粕浓度为12%、KCl为0.01%、MgSO4为0.05%。通过发酵工艺条件参数的正交优化试验得出发酵培养基的最佳工艺参数为：发酵时间为48 h，装瓶量为50 mL，种龄为14 h，pH值为6.5。在此条件下B-15菌株发酵产蛋白酶活力为125.05 U/mL，与基础发酵培养基相比，提高了11.9%。

关键词：液体发酵；发酵条件；正交优化；蛋白酶活力

中图分类号：TQ920.1 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0273-03

大豆肽是一种比大豆蛋白质更为优质、新型的大豆蛋白酶改性产品，广泛应用于发酵、制药、食品、化妆品、饲料及植物营养剂等行业^[1-3]。大豆肽易消化吸收，能迅速供给机体能量，无蛋白变性，无豆腥味，液体黏性小和受热不凝固等，并具有降低血清胆固醇^[4]、降低血压、抗疲劳^[5]、抗氧化^[6]等许多生物功能，因此大豆肽成为研究热点。目前，大豆肽多采用酶解法和微生物发酵法生产^[7]，微生物发酵法把蛋白酶的发酵生产和大豆肽的酶解生产有机结合在一起，降低了大豆肽功能的生产成本，克服了酶水解法制备大豆肽产品的苦味大和口感差等缺点^[8]。目前，利用微生物发酵法生产大豆肽被认为是较先进有效方法，应用前景较好。本试验以蛋白酶活力为指标，通过单因素和正交试验对产蛋白酶芽孢杆菌 B-15 发酵处理豆粕的产酶培养基组成、发酵工艺条件进行了优化，以确定最佳的豆粕发酵产酶工艺，为大豆肽的大规模液态发酵生产奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 细菌菌株：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B-15，由河北农业大学生命科学学院制药工程实验室分离并保存。

1.1.2 培养基 NA培养基、NB培养基的配制详见文献[9]。种子培养基即NB培养基；基础发酵培养基：豆粕10%、Na2HPO4 0.84%、KH2PO4 0.032%、CaCl2 0.17%、混匀后调pH值6.0～6.5。

1.1.3 试剂

福林-酚试剂；0.55 mol/L 碳酸钠溶液、10% 三氯醋酸溶液、0.02 mol/L pH值7.5磷酸缓冲液、1%酪蛋白溶液、100 μg/mL标准酪氨酸溶液，所用试剂皆为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的培养与发酵

1.2.1.1 摇瓶种子曲线（生长曲线）及种子培养

将斜面培养的菌株接种于NB培养基中，250 mL三角瓶中的装瓶量为75 mL（250 mL，下同），在37 ℃下180 r/min振荡培养，在零时开始取样，以后每隔1 h或2 h取样1次，直至培养24 h为止，以未接菌的培养基作空白调零，用分光光度计在600 nm下测D，以发酵时间为x轴、以D为y轴作曲线，绘制生长曲线。将斜面培养的菌株接种于NB培养基中，装瓶量为 75 mL，180 r/min摇床培养，培养时间由生长曲线确定，得到种子液。

1.2.1.2 发酵培养

对培养基成分采用以下的培养条件进行优化：将种子液以2%的接种量接入75 mL/250 mL三角瓶发酵培养基中，于37 ℃、180 r/min下振荡培养48 h，将发酵液在5 000 r/min条件下离心10 min，弃去沉淀，收集上清液，进行蛋白酶活力测定。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 不同碳源

分别以2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米淀粉、D-果糖等7种碳源进行B-15菌株产酶活力比较试验，配制7种碳源不同的发酵培养基，均加入10%氮源豆粕，0.84% Na2HPO4，0.032% KH2PO4，0.17% CaCl2，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适碳源。

1.2.2.2 不同氮源浓度

配制豆粕浓度分别为2%、5%、8%、11%、14%的培养基发酵培养，进行B-15菌株产酶活力比较试验，均加入2%最适碳源，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4、0.17% CaCl2，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适氮源浓度。

1.2.2.3 不同无机盐

以浓度为0.05%的CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnCl2、KCl、NaCl、ZnCl2等7种供试无机盐进行B-15菌株产酶活力比较试验，配制7种无机盐不同的发酵培养基，均加入2%最适碳源，最适氮源浓度的豆粕，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适2种无机盐。

1.2.3 正交试验

1.2.3.1 培养基组分

在培养基各组分初步筛选的基础上，研究培养基成分的不同配比对酶活力的影响。选用L16（44）设计方案设计4因素4水平正交试验（表1），根据上述试验确定的最适碳源、氮源、无机盐配制不同组成的培养基，测定发酵菌株产酶活力。综合正交试验结果，初步确定最佳组合，得出B-15菌株产酶的最佳培养基组成。

肽发酵培养基最佳组成，即葡萄糖为2%，豆粕浓度为12%，KCl为0.01%，MgSO4为0.05%。通过对其进行发酵工艺条件参数的正交优化试验得出发酵培养基的最佳工艺参数，即发酵时间为48 h，装瓶量为50 mL，种龄为14 h，pH值为6.5。在此条件下，B-15菌株发酵产蛋白酶活力为125.05 U/mL，与基础发酵培养基相比提高了11.9%，研究结果为进一步利用豆粕提供了理论依据。

参考文献：

[1]豆康宁，董 彬，王银满. 大豆蛋白活性肽的生物功能与应用前景[J]. 粮食加工，2007，32（2）：52-54.

[2]邓成萍，张 惠，魏秀英.大豆低聚肽的研究进展[J]. 食品科学，2004，25（增刊）：236-240.

[3]王 静，郝再彬. 大豆肽的特性和功能及研究进展[J]. 黑龙江农业科学，2004（5）：32-36.

[4]宋俊梅，曲静然，徐少萍. 大豆肽的研究进展（待续）[J]. 山东轻工业学院学报，2002，16（3）：1-3.

[5]郑哲君，李晓莉，王 朔. 抗疲劳功能食品的研究进展[J]. 食品科技，2006，31（2）：4-7.

[6]Chen H M，Muramoto K，Yamauchi F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. Agric and Food Chem，1995，43（5）：574-578.

[7]方海红，胡好远，黄红英，等. 微生物碱性蛋白酶的研究进展[J]. 微生物学通报，2002，29（2）：57-59.

[8]邓 勇，吴煜欢. 微生物蛋白酶对大豆分离蛋白水解作用的研究[J]. 食品科学，1999，20（6）：42-45.

[9]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：351.

[10]Iemura Y，Yamada T，Takahashi T，et al. Properties of the peptides liberated from rice protein in sokujo-moto[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，1999，88（3）：276-280.

[11]李志忠，袁惠君，张丙云，等. 大豆多肽的功能与开发研究[J]. 甘肃科技，2006，22（4）：179-181.endprint

摘要：为了提高B-15菌株发酵豆粕产蛋白酶能力，采用单因素法对 B-15菌株发酵培养基所需的碳源、氮源、无机盐进行筛选，采用正交试验对B-15菌株的发酵培养基组成及发酵培养条件进行优化，最终确定最适发酵培养基组成为葡萄糖为2%、豆粕浓度为12%、KCl为0.01%、MgSO4为0.05%。通过发酵工艺条件参数的正交优化试验得出发酵培养基的最佳工艺参数为：发酵时间为48 h，装瓶量为50 mL，种龄为14 h，pH值为6.5。在此条件下B-15菌株发酵产蛋白酶活力为125.05 U/mL，与基础发酵培养基相比，提高了11.9%。

关键词：液体发酵；发酵条件；正交优化；蛋白酶活力

中图分类号：TQ920.1 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0273-03

大豆肽是一种比大豆蛋白质更为优质、新型的大豆蛋白酶改性产品，广泛应用于发酵、制药、食品、化妆品、饲料及植物营养剂等行业^[1-3]。大豆肽易消化吸收，能迅速供给机体能量，无蛋白变性，无豆腥味，液体黏性小和受热不凝固等，并具有降低血清胆固醇^[4]、降低血压、抗疲劳^[5]、抗氧化^[6]等许多生物功能，因此大豆肽成为研究热点。目前，大豆肽多采用酶解法和微生物发酵法生产^[7]，微生物发酵法把蛋白酶的发酵生产和大豆肽的酶解生产有机结合在一起，降低了大豆肽功能的生产成本，克服了酶水解法制备大豆肽产品的苦味大和口感差等缺点^[8]。目前，利用微生物发酵法生产大豆肽被认为是较先进有效方法，应用前景较好。本试验以蛋白酶活力为指标，通过单因素和正交试验对产蛋白酶芽孢杆菌 B-15 发酵处理豆粕的产酶培养基组成、发酵工艺条件进行了优化，以确定最佳的豆粕发酵产酶工艺，为大豆肽的大规模液态发酵生产奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 细菌菌株：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B-15，由河北农业大学生命科学学院制药工程实验室分离并保存。

1.1.2 培养基 NA培养基、NB培养基的配制详见文献[9]。种子培养基即NB培养基；基础发酵培养基：豆粕10%、Na2HPO4 0.84%、KH2PO4 0.032%、CaCl2 0.17%、混匀后调pH值6.0～6.5。

1.1.3 试剂

福林-酚试剂；0.55 mol/L 碳酸钠溶液、10% 三氯醋酸溶液、0.02 mol/L pH值7.5磷酸缓冲液、1%酪蛋白溶液、100 μg/mL标准酪氨酸溶液，所用试剂皆为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的培养与发酵

1.2.1.1 摇瓶种子曲线（生长曲线）及种子培养

将斜面培养的菌株接种于NB培养基中，250 mL三角瓶中的装瓶量为75 mL（250 mL，下同），在37 ℃下180 r/min振荡培养，在零时开始取样，以后每隔1 h或2 h取样1次，直至培养24 h为止，以未接菌的培养基作空白调零，用分光光度计在600 nm下测D，以发酵时间为x轴、以D为y轴作曲线，绘制生长曲线。将斜面培养的菌株接种于NB培养基中，装瓶量为 75 mL，180 r/min摇床培养，培养时间由生长曲线确定，得到种子液。

1.2.1.2 发酵培养

对培养基成分采用以下的培养条件进行优化：将种子液以2%的接种量接入75 mL/250 mL三角瓶发酵培养基中，于37 ℃、180 r/min下振荡培养48 h，将发酵液在5 000 r/min条件下离心10 min，弃去沉淀，收集上清液，进行蛋白酶活力测定。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 不同碳源

分别以2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米淀粉、D-果糖等7种碳源进行B-15菌株产酶活力比较试验，配制7种碳源不同的发酵培养基，均加入10%氮源豆粕，0.84% Na2HPO4，0.032% KH2PO4，0.17% CaCl2，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适碳源。

1.2.2.2 不同氮源浓度

配制豆粕浓度分别为2%、5%、8%、11%、14%的培养基发酵培养，进行B-15菌株产酶活力比较试验，均加入2%最适碳源，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4、0.17% CaCl2，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适氮源浓度。

1.2.2.3 不同无机盐

以浓度为0.05%的CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnCl2、KCl、NaCl、ZnCl2等7种供试无机盐进行B-15菌株产酶活力比较试验，配制7种无机盐不同的发酵培养基，均加入2%最适碳源，最适氮源浓度的豆粕，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适2种无机盐。

1.2.3 正交试验

1.2.3.1 培养基组分

在培养基各组分初步筛选的基础上，研究培养基成分的不同配比对酶活力的影响。选用L16（44）设计方案设计4因素4水平正交试验（表1），根据上述试验确定的最适碳源、氮源、无机盐配制不同组成的培养基，测定发酵菌株产酶活力。综合正交试验结果，初步确定最佳组合，得出B-15菌株产酶的最佳培养基组成。

肽发酵培养基最佳组成，即葡萄糖为2%，豆粕浓度为12%，KCl为0.01%，MgSO4为0.05%。通过对其进行发酵工艺条件参数的正交优化试验得出发酵培养基的最佳工艺参数，即发酵时间为48 h，装瓶量为50 mL，种龄为14 h，pH值为6.5。在此条件下，B-15菌株发酵产蛋白酶活力为125.05 U/mL，与基础发酵培养基相比提高了11.9%，研究结果为进一步利用豆粕提供了理论依据。

参考文献：

[1]豆康宁，董 彬，王银满. 大豆蛋白活性肽的生物功能与应用前景[J]. 粮食加工，2007，32（2）：52-54.

[2]邓成萍，张 惠，魏秀英.大豆低聚肽的研究进展[J]. 食品科学，2004，25（增刊）：236-240.

[3]王 静，郝再彬. 大豆肽的特性和功能及研究进展[J]. 黑龙江农业科学，2004（5）：32-36.

[4]宋俊梅，曲静然，徐少萍. 大豆肽的研究进展（待续）[J]. 山东轻工业学院学报，2002，16（3）：1-3.

[5]郑哲君，李晓莉，王 朔. 抗疲劳功能食品的研究进展[J]. 食品科技，2006，31（2）：4-7.

[6]Chen H M，Muramoto K，Yamauchi F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. Agric and Food Chem，1995，43（5）：574-578.

[7]方海红，胡好远，黄红英，等. 微生物碱性蛋白酶的研究进展[J]. 微生物学通报，2002，29（2）：57-59.

[8]邓 勇，吴煜欢. 微生物蛋白酶对大豆分离蛋白水解作用的研究[J]. 食品科学，1999，20（6）：42-45.

[9]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：351.

[10]Iemura Y，Yamada T，Takahashi T，et al. Properties of the peptides liberated from rice protein in sokujo-moto[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，1999，88（3）：276-280.

[11]李志忠，袁惠君，张丙云，等. 大豆多肽的功能与开发研究[J]. 甘肃科技，2006，22（4）：179-181.endprint