松茸菌丝体液体培养方式及其最适培养基的筛选

张丽+郭成金

摘要：首次通过对松茸菌丝体的液体培养方式的比较，选择以间歇性手摇的方式进行筛选，以松茸菌丝体生物量（干质量）为主要指标，首先采用单因素试验分别筛选出2种最适碳氮源，再结合L9（34）正交设计方法，最终得到最适液体培养基配方：蔗糖30.00 g/L，麦芽糖20.00 g/L，酵母粉2.50 g/L，麦麸25.00 g/L（浸提液），KH2PO4 2.50 g/L，MgSO4·7H2O 1.50 g/L，维生素B1 8 mg/L，pH值自然条件。25 ℃静置培养12 h，再每隔12 h水平往复手摇约5 min，培养72 h，其生物量可达10.92 g/L。与前人试验结果相比，该方式周期更短，生物量更高。

关键词：松茸；间歇性手摇；菌丝体；生物量；液体培养基；正交设计；周期。

中图分类号：S646.1+50.4+3 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0245-03

松茸[Tricholoma matsutake （S. Ito & S. Imai） Singer]别称松口蘑，属担子菌门伞菌亚门伞菌纲伞菌亚纲伞菌目口蘑科口蘑属^[1]，是一种珍稀濒危的食药用真菌，国家级二级保护植物，有极高的营养价值和经济价值^[2]。松茸是共生菌，世界范围内研究松茸人工栽培已有几十年的历史，然而至今仍无突破性的成果。目前，随着松茸生理生态研究的深入，松茸菌丝的纯培养及子实体的仿生态栽培已取得了一定的进展，但仅能做到接种式的半人工栽培，真正的人工栽培还没有实现^[3-4]。目前，很多国内外学者采用高新技术从分子生物学角度研究松茸外生菌根的形成机理、分子特性和它们的遗传特征序列^[5-8]，以此作为分子标记，既可研究松茸的起源和亲缘关系，又可为建立松茸基因库打下基础，以备将来用以挽救其可能灭绝的命运^[3]。自日本学者洪田捻（1947）、广江勇（1957）和小川真（1987）等先后报道了分离培养松茸菌丝体的方法、培养基、菌落形态和菌丝类型^[9]并为松茸菌种分离提供了成功的经验以来，人们采用不同的方法从不同的角度对松茸菌丝体纯培养^[10-11]、液体发酵^[12-13]等进行了许多研究，通过对松茸菌丝体的获得、扩繁及其鉴定证实了在合理控制试验条件下可以进行松茸菌丝体液体扩繁，且扩繁后的菌丝体与原种依然保持种质的一致性^[14]。笔者运用不同于前人的试验设计，通过碳氮源单因素试验，并结合L9（34）正交设计对松茸菌丝体最适液体培养基进行了系统的筛选，为松茸液体发酵及今后的育种等提供了理论依据及技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

松茸，由北京北纳创联生物技术研究院提供，编号为ACC51071。

1.2 培养基

1.2.1 综合培养基 棉籽皮200.00 g/L（浸提液）、马铃薯200.00 g/L（浸提液）、葡萄糖20.00 g/L、KH2PO4 3.00 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、维生素B1 0.004 g/L、琼脂18.00 g/L，pH值自然条件。

1.2.2 碳源初选培养基 酵母粉3.00 g/L，KH2PO4 3.00 g/L，MgSO4·7H2O 1.50 g/L，维生素B1 0.004 g/L，pH值自然条件。分别以葡萄糖 20.00 g/L、麦芽糖 20.00 g/L、蔗糖 20.00 g/L、马铃薯200.00 g/L（浸提液）、玉米20.00 g/L（浸提液）为供试碳源。

1.2.3 氮源初选培养基 葡萄糖20.00 g/L，KH2PO4 3.00 g/L，MgSO4·7H2O 1.50 g/L，维生素B1 4 mg/L，pH值自然。分别以酵母粉3.00 g/L、蛋白胨3.00 g/L、牛肉膏3.00 g/L、硝酸铵3.00 g/L、麦麸20.00 g/L（浸提液）为供试氮源。

1.3 试剂与仪器设备

SW-CJ-2FD 双人单面净化工作台（江苏苏州净化设备有限公司）；YXQG02手提式压力蒸汽消毒器（山东新华医疗器械厂）；WDP型微生物多用培养箱（广东省医疗器械厂）；BS224S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统股份有限公司）；AP-01D 真空泵（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）；DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种活化与提纯复壮 将保存的松茸菌种提前3 d活化，在无菌条件下接种于斜面综合培养基上，25 ℃培养 5 d，再挑取健壮的菌丝前端，接种于平板综合培养基上，于 25 ℃ 培养 6 d，备用。

1.4.2 菌丝体液体培养 用打孔器在生长健壮的菌丝体前端，挑取大小相同约0.5 cm2的菌块，接种于液体培养基中，每瓶5块。25 ℃静置培养12 h，再每隔12 h水平往复手摇约5 min，培养72 h，每个水平3次重复。

1.4.3 菌丝体干质量测量 滤纸编号，分别用电子天平称重，将培养84 h的松茸菌丝体抽滤后，于60 ℃烘箱中烘干至恒重，用电子天平再次称重。

1.4.4 碳氮源培养基正交试验 依据碳源、氮源单因素试验的结果，各选择2个较好的碳氮源，按L9（34）设计4因素3水平正交试验（表1）进行复选，与KH2PO4 3.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、维生素B1 0.004 g/L组成9个试验配方，筛选出最佳碳氮源组合。

2 结果与分析

2.1 不同液体培养方式对松茸菌丝体生长状况的影响endprint

试验初期笔者首次进行了3种液体培养方式的筛选，分别为静置培养（图1-a）、120 r/min摇床培养（图1-b）和间歇性手摇培养（图1-c），各72 h。由于松茸菌丝生长迅速，静置培养12 h后菌丝体即可连成片，浮于液体表面，抽滤后菌丝体生物量误差较大，且不利于获取菌丝体片段。摇床培养的液体浑浊，菌丝细小黏稠，不宜抽滤和分离。间歇性手摇是接种后静置培养12 h，再每隔12 h水平往复手摇约5 min，培养一段时间后的菌丝体分布均匀，清晰可见，较容易抽滤，且动静相间法所培养的菌丝体更有利于原生质体的制备和诱变育种^[15]，所以最终采取间歇性手摇方式进行后期试验。

2.2 不同碳源对松茸菌丝体生物量的影响

碳源是构成细胞基本骨架的营养物质，同时也为基本生命过程提供能源，试验结果（表3）表明，在5种供试碳源中，以蔗糖为碳源的菌丝体生物量最高，麦芽糖次之，再次为葡萄糖、玉米粒，马铃薯最低。统计学方差分析结果（表4）表明，F值为14.478>F0.01（4，10）=5.994^[16]，表明不同碳源培养基对松茸菌丝体生物量的影响在0.01水平上差异显著。Duncans

3 结论

试验结果表明，松茸菌丝体生长的最适液体培养基为蔗糖30.00 g/L、麦芽糖20.00 g/L、酵母粉2.50 g/L、麦麸 25.00 g/L（浸提液）、KH2PO4 2.50 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、维生素B1 8 mg/L，pH值自然条件。25 ℃静置培养12 h，再每隔12 h 水平往复手摇约5 min，培养72 h，其生物量可达 10.92 g/L，与前人试验结果相比，本研究周期更短，生物量更高。采用间歇性手摇的方式培养，得到的菌丝体分散均匀，生物量高，便于日后的原生质体制备和诱变育种。

参考文献：

[1]戴玉成，杨祝良. 中国药用真菌名录及部分名称的修订[J]. 菌物学报，2008，27（6）：801-824.

[2]弓明钦，王凤珍. 从国际松茸市场动向看国产松茸的应对措施[J]. 国土与自然资源研究，2004，02（2）：88-89.

[3]周选围. 松茸资源研究概况[J]. 食用菌学报，2002，9（1）：50-56.

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[6]Kataoka R，Siddiqui Z A，Kikuchi J，et al. Detecting nonculturable bacteria in the active mycorrhizal zone of the pine mushroom Tricholoma matsutake[J]. Journal of Microbiology，2012，50（2）：199-206.

[7]Vaario L M，Fritze H，Spetz P，et al.Tricholoma matsutake dominates diverse microbial communities in different forest soils[J]. Appl Environ Microbiol，2011，77（24）：8523-8531.

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[9]刘振钦，高勇秀，王子权. 松茸菌丝体分离培养研究初报[J]. 吉林农业大学学报，1989，11（2）：13-16，120.

[10]Hirato H，Kitamoto Y. Effect of physico-chemical characteristics of the culture substrate and nutritional conditions on mycelial growth in Tricholoma matsutake[J]. Mushroom Sci Biotechnol，1995（2）：17-22.

[11]曹张军，张兴群，吕小鹰，等. 一个适合松茸菌丝生长的加富培养基[J]. 食用菌学报，2007，14（3）：41-43.

[12]李长田，刁盈盈，毛欣欣，等. 松茸液态发酵菌丝生长量因子的研究[J]. 菌物学报，2012，31（2）：229-234.

[13]王淑珍，白 晨，高 雁，等. 松茸液态发酵培养基的筛选与科学依据[J]. 食用菌，2000，22（6）：4-5.

[14]张微思，罗孝坤，张丽英，等. 松茸菌丝体的纯培养及其鉴定[J]. 中国食用菌，2010，29（3）：34-36.

[15]曲鸿雁，郭成金.冬虫夏草与蛹虫草融合子菌丝体液体培养基筛选[J]. 中国酿造，2013，32（3）：106-109.

[16]杜荣骞.生物统计学[M]. 北京：高等教育出版社，2003：263-265.

[17]曾东方，陈 玢，高孟文. 不同氮源对松茸菌丝生长的影响[J]. 食用菌，2010，32（4）：10-11.

[18]赵秀芳. 不同碳氮源对松口蘑菌丝生长的影响[J]. 安徽农业科学，2005，33（3）：429-429，431.

[19]刘西周，郭成金. 采用L9（34）正交设计方法筛选血耳菌丝体液体培养基[J]. 中国食用菌，2009，28（1）：36-38.

[20]杨民和，杨新美，陈立国.松茸的营养生理及培养基的筛选[J]. 菌物系统，2000，19（2）：272-277.endprint

试验初期笔者首次进行了3种液体培养方式的筛选，分别为静置培养（图1-a）、120 r/min摇床培养（图1-b）和间歇性手摇培养（图1-c），各72 h。由于松茸菌丝生长迅速，静置培养12 h后菌丝体即可连成片，浮于液体表面，抽滤后菌丝体生物量误差较大，且不利于获取菌丝体片段。摇床培养的液体浑浊，菌丝细小黏稠，不宜抽滤和分离。间歇性手摇是接种后静置培养12 h，再每隔12 h水平往复手摇约5 min，培养一段时间后的菌丝体分布均匀，清晰可见，较容易抽滤，且动静相间法所培养的菌丝体更有利于原生质体的制备和诱变育种^[15]，所以最终采取间歇性手摇方式进行后期试验。

2.2 不同碳源对松茸菌丝体生物量的影响

碳源是构成细胞基本骨架的营养物质，同时也为基本生命过程提供能源，试验结果（表3）表明，在5种供试碳源中，以蔗糖为碳源的菌丝体生物量最高，麦芽糖次之，再次为葡萄糖、玉米粒，马铃薯最低。统计学方差分析结果（表4）表明，F值为14.478>F0.01（4，10）=5.994^[16]，表明不同碳源培养基对松茸菌丝体生物量的影响在0.01水平上差异显著。Duncans

3 结论

试验结果表明，松茸菌丝体生长的最适液体培养基为蔗糖30.00 g/L、麦芽糖20.00 g/L、酵母粉2.50 g/L、麦麸 25.00 g/L（浸提液）、KH2PO4 2.50 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、维生素B1 8 mg/L，pH值自然条件。25 ℃静置培养12 h，再每隔12 h 水平往复手摇约5 min，培养72 h，其生物量可达 10.92 g/L，与前人试验结果相比，本研究周期更短，生物量更高。采用间歇性手摇的方式培养，得到的菌丝体分散均匀，生物量高，便于日后的原生质体制备和诱变育种。

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[20]杨民和，杨新美，陈立国.松茸的营养生理及培养基的筛选[J]. 菌物系统，2000，19（2）：272-277.endprint

试验初期笔者首次进行了3种液体培养方式的筛选，分别为静置培养（图1-a）、120 r/min摇床培养（图1-b）和间歇性手摇培养（图1-c），各72 h。由于松茸菌丝生长迅速，静置培养12 h后菌丝体即可连成片，浮于液体表面，抽滤后菌丝体生物量误差较大，且不利于获取菌丝体片段。摇床培养的液体浑浊，菌丝细小黏稠，不宜抽滤和分离。间歇性手摇是接种后静置培养12 h，再每隔12 h水平往复手摇约5 min，培养一段时间后的菌丝体分布均匀，清晰可见，较容易抽滤，且动静相间法所培养的菌丝体更有利于原生质体的制备和诱变育种^[15]，所以最终采取间歇性手摇方式进行后期试验。

2.2 不同碳源对松茸菌丝体生物量的影响

碳源是构成细胞基本骨架的营养物质，同时也为基本生命过程提供能源，试验结果（表3）表明，在5种供试碳源中，以蔗糖为碳源的菌丝体生物量最高，麦芽糖次之，再次为葡萄糖、玉米粒，马铃薯最低。统计学方差分析结果（表4）表明，F值为14.478>F0.01（4，10）=5.994^[16]，表明不同碳源培养基对松茸菌丝体生物量的影响在0.01水平上差异显著。Duncans

3 结论

试验结果表明，松茸菌丝体生长的最适液体培养基为蔗糖30.00 g/L、麦芽糖20.00 g/L、酵母粉2.50 g/L、麦麸 25.00 g/L（浸提液）、KH2PO4 2.50 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、维生素B1 8 mg/L，pH值自然条件。25 ℃静置培养12 h，再每隔12 h 水平往复手摇约5 min，培养72 h，其生物量可达 10.92 g/L，与前人试验结果相比，本研究周期更短，生物量更高。采用间歇性手摇的方式培养，得到的菌丝体分散均匀，生物量高，便于日后的原生质体制备和诱变育种。

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[4]邵丽丽，王艳臣，罗春玲. 松口蘑研究现状及发展趋势[J]. 中国林副特产，2009，101（4）：109-110.

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[7]Vaario L M，Fritze H，Spetz P，et al.Tricholoma matsutake dominates diverse microbial communities in different forest soils[J]. Appl Environ Microbiol，2011，77（24）：8523-8531.

[8]Ding X，Hou Y L. Identification of genetic characterization and volatile compounds of Tricholoma matsutake from different geographical origins[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2012，44（44）：233-239.

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[12]李长田，刁盈盈，毛欣欣，等. 松茸液态发酵菌丝生长量因子的研究[J]. 菌物学报，2012，31（2）：229-234.

[13]王淑珍，白 晨，高 雁，等. 松茸液态发酵培养基的筛选与科学依据[J]. 食用菌，2000，22（6）：4-5.

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[15]曲鸿雁，郭成金.冬虫夏草与蛹虫草融合子菌丝体液体培养基筛选[J]. 中国酿造，2013，32（3）：106-109.

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[18]赵秀芳. 不同碳氮源对松口蘑菌丝生长的影响[J]. 安徽农业科学，2005，33（3）：429-429，431.

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