钼对小鼠睾丸NO含量及ATPase活性的影响

林霖+任洪涛+张才+李健+王宏伟+杨自军

摘要：为探讨钼对小鼠睾丸NO含量及ATPase活性的影响，选用60只雄性昆明种小鼠，随机分成对照组、钼100组、钼200组、钼400组共4组，即饮水中分别添加0、100、200、400 mg/L钼（钼源为钼酸钠），连续染毒90 d，检测小鼠睾丸组织形态结构，睾丸组织NO含量及ATP酶活性。结果表明，钼染毒小鼠睾丸生精细胞变性，精子减少，睾丸组织NO含量升高，睾丸组织Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性下降，这可能是钼导致雄性小鼠生殖障碍的毒性机制。

关键词：钼；睾丸；NO；ATP酶；小鼠

中图分类号：S858.91 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0195-02

钼是动物必需的微量元素，是黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶的重要组成成分，参与机体的生长发育及核酸代谢；钼也是一种金属毒物，当过量的钼进入动物机体时，不仅会造成肝、肾等组织脏器损伤^[1-2]，还会影响动物生殖系统的结构与功能^[3]。本研究通过检测钼对小鼠睾丸组织ATP酶活性和NO含量的影响，为探讨钼对雄性小鼠生殖毒作用机制提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 清洁级健康昆明种雄性小白鼠60只，体重（16±1） g/只，由河南科技大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 钼酸钠分析纯，天津市化学试剂四厂生产；NO测试盒、总蛋白测试盒及ATP酶试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理 健康昆明系雄性小白鼠60只，随机分为4组，即对照组、钼100组、钼200组和钼400组，每组15只，分别饮用由钼酸钠配制、含钼浓度为0、100、200、400 mg/L 去离子水。小鼠常规饲养，自由取食、饮水，染毒时间90 d。

1.2.2 睾丸组织切片制作、匀浆的制备及指标检测 染毒90 d后，各组取小鼠5只，颈椎脱臼处死；打开腹腔，迅速摘取睾丸，去除外膜及血管，用4 ℃预冷生理盐水洗净血液，滤纸吸干水分。睾丸一侧用中性甲醛固定，常规制作石蜡切片，HE染色，光镜检测；另一侧精确称重，眼科剪剪碎，加冰浴生理盐水，用玻璃匀浆器制成质量浓度为10%的组织匀浆，冷冻离心机3 000 r/min离心10 min，弃去沉淀，取上清液，置 -20 ℃ 冰箱中保存待测。严格按照试剂盒操作规程，测定睾丸组织液中NO含量以及Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力，以1 h 1 mg蛋白分解ATP酶产生1 μmol的Pi量为1个ATP酶活力单位，即1 μmol/（mg·h）。

1.3 数据处理

数据采用“x±s”表示，利用SPSS 17.0统计软件，采取单因素方差分析比较组间差异。

2 结果与分析

2.1 钼对小鼠睾丸组织NO含量及ATP酶活性的影响

由表1可见，小鼠睾丸组织NO含量随染毒剂量的增加而增加；钼200组较对照组差异显著（P<0.01），钼400组较对照组差异极显著（P<0.01）；小鼠睾丸组织Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活力随染毒剂量的增加，活性逐渐降低；钼200组及钼400组Na+-K+-ATP酶活性降低较对照组差异极显著（P<0.01），钼200组Ca2+-ATP酶的活力降低较对照组差异显著（P<0.05），钼400组Ca2+-ATP酶的活力降低较对照组差异极显著（P<0.01）。

Na+-K+-ATP酶为细胞膜上跨膜载体蛋白，能将细胞内的Na+泵出细胞外，同时将细胞外的K+泵入细胞内，Na+-K+-ATP 酶不仅能通过水解ATP为生命活动提供能量，还对细胞稳态的维持发挥重要作用。Ca2+-ATP酶通过磷酸化和去磷酸化的变构效应，调控细胞内外的Ca2+浓度，维持细胞内Ca2+的稳态，对维持细胞内外电位平衡及细胞信使的传递有重要的生物学意义，还可调控细胞内Mg2+浓度，影响细胞内DNA合成^[4]，从而影响组织细胞物质交换及能量代谢。研究发现，多种重金属物质如镉、铅等可以通过抑制Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活力来影响动物的生殖功能^[5]。本研究发现，钼染毒小鼠睾丸组织中的Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活力下降，钼可抑制雄性小鼠睾丸生精细胞和支持细胞物质交换及能量代谢，引起小鼠睾丸形态结构改变，导致精子生成减少。

NO是机体内的一种生物信号分子，同时还是一气体类自由基，具有高度的活泼性和极强的氧化反应能力。内源性NO由一氧化氮合酶催化L-精氨酸产生，生理范围内NO水平对机体是有益的；当NO生成过多，会产生极强的细胞毒作用，导致睾丸组织细胞脂质过氧化损伤^[6]，造成核酸、蛋白、糖类和脂质等细胞成分损伤，从而导致能量代谢受到抑制，三羧酸循环、氧化磷酸化和糖酵解受到干扰，影响精子的正常发生及获能^[7]。Kai研究发现，过多的自由基攻击可直接破坏Na+-K+-ATP酶结构，导致Na+-K+-ATP酶活性下降，进一步导致细胞内Na+增多，从而激活细胞膜上的Na+-Ca2+交换蛋白，使细胞内Ca2+增多，Ca2+-ATP酶活性减弱，细胞内钙超载，干扰线粒体氧化磷酸化反应，ATP生成减少，加重细胞能量耗竭，ATP酶活性进一步降低^[8]。本研究发现，钼染毒小鼠睾丸中的NO生成增多，并且随着钼染毒剂量的增加，睾丸组织NO含量也随着增多，睾丸组织细胞损伤程度也越显著，这与文献报道结果^[9]相一致。另外，高浓度的NO还可以通过cGMP介导作用抑制睾酮分泌^[10]，导致生精功能降低，这也可能是高剂量钼影响雄性生殖功能的另一个途径。endprint

综上所述，钼对睾丸的细胞毒作用存在NO毒作用机制，并可通过抑制Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性影响生殖功能。

参考文献：

[1]肖 杰，崔恒敏，杨 帆，等. 高钼对雏鸡肾脏的病理损伤和抗氧化功能的影响[J]. 畜牧兽医学报，2010，41（12）：1598-1604.

[2]周变华，林 霖，杨自军，等. 钼对小鼠脂质过氧化损伤及肝Smac和Bax表达的影响[J]. 中国兽医科学，2012，42（6）：617-621.

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[10]Valenti S，Cuttica C M，Fazzuoli L，et al. Biphasic effect of nitric oxide on testosterone and cyclic GMP production by purified rat leydig cells cultured in vitro[J]. International Journal of Andrology，1999，22（5）：336-341.endprint

综上所述，钼对睾丸的细胞毒作用存在NO毒作用机制，并可通过抑制Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性影响生殖功能。

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