筛选和利用海洋细菌防治玉米纹枯病试验

李德全+谈蓉+周鸣鸣+邓自发

摘要：从江苏省南通市沿海滩涂、近海海水、海藻体内分离到了862株海洋细菌，以玉米纹枯菌为指示菌对其抑菌活性进行检测，经初筛、复筛、定量复筛，获得7株抑菌效果较好的拮抗细菌，并对筛选出的高效拮抗菌株进行室内抑菌及田间防病测定试验。结果表明， NH-8菌株的拮抗活性和防效最强，通过形态特征、生理生化及16S rDNA同源性序列分析，初步鉴定该菌株为芽孢杆菌。

关键词：海洋细菌；玉米纹枯病；芽孢杆菌

中图分类号：S435.131.4+9 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0118-03

玉米纹枯病是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）侵染所致的土传病害。在我国，玉米纹枯病最早于1966年仅吉林省有发生记载，继吉林省之后，辽宁省、湖北省、广西壮族自治区、河南省、山西省、浙江省、陕西省、河北省、四川省、山东省、江苏省等省（区）均陆续有玉米纹枯病发生的报道^[1]。近年来，随着玉米感病品种的种植与推广，玉米纹枯病发生与危害日趋严重，已成为玉米高产、稳产的主要限制因子之一^[2]。由于纹枯病菌腐生能力强、寄主范围很广，国内外至今尚未发现该病的高抗玉米品种，生产中主要采用化学杀菌剂进行防治^[3-4]。长期连续使用化学农药，容易导致病菌产生抗药性。生物防治用生态学方法控制有害生物，避免使用化学农药带来的一系列环境、能源问题，促进农业可持续发展^[5-8]。随着研究的深入，从陆生资源中分离筛选出新的有效生防资源菌变得越来越困难，探索新的生防资源迫在眉睫。海洋微生物由于其生长环境很特殊而受到学者们的关注，已有从海洋中分离筛选出植物病害生防微生物的报道^[9-11]。但筛选利用海洋细菌用于玉米纹枯病的生物防治目前尚未见报道。本研究从江苏省南通市沿海滩涂近海海水及海藻中分离筛选到多株对玉米纹枯病菌具有较强拮抗性能的海洋生防细菌，旨在为防治植物病害提供新的生防资源。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

样品采集点为南通市沿海滩涂、近海海水、海藻体内。沿海滩涂取植物根际土壤，近海海水取样地点距海岸1～2 km，选取多点采样。将样品密封于灭菌的容器，带回实验室4 ℃保存^[12]。

1.2 供试病原菌

玉米纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、小麦全蚀病菌（Gaetanannomyces graminis）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp.vasinfectum）、小麦根腐病菌（Helminthosporium sorokianum）由笔者所在实验室提供。花椰菜根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicicola）菌株由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。玉米品系YQ7-96 由广西大学农学院吴子恺教授提供。

1.3 供试培养基

海水PYS培养基：蛋白胨5 g、酵母膏5 g、MgCl2·2H2O 2 g、葡萄糖5 g、NaCl 16 g、陈海水1 000 mL，用于拮抗细菌的分离、纯化、培养^[13-14] 。PDA培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL，用于植物病原真菌培养。培养基pH值均为7.0～7.2。

1.4 拮抗细菌的筛选

1.4.1 细菌分离 用稀释法分离海洋细菌，将分离物平板置于26 ℃培养箱中培养72 h，挑取单菌落纯化，移植斜面保存于PYS培养基中。

1.4.2 初筛 以玉米纹枯病菌为指示菌，采用平板对峙法^[15]筛选拮抗菌株。将纹枯菌移植到PDA平板上，26 ℃培养48 h，用打孔器在带菌PDA平板上打孔，在不带菌的PDA平板上呈对角点接海洋细菌，24 h后在平板中央移入纹枯菌菌盘，26 ℃下培养48 h，测量拮抗带宽度。每处理重复3次，对抑菌作用快且强的海洋细菌进行定量复筛。

1.4.3 复筛 将初筛菌株移植到海水PYS培养基中，培养液在26 ℃、140 r/min条件下振荡培养48 h，用移液枪移取 10 μL 菌液，滴在PDA平板上直径约6 cm的灭菌滤纸片上，进行定量复筛。测量抑菌圈半径，抑菌率计算公式如下：

抑菌率=（2×抑菌圈半径）/45×100%。

1.5 拮抗菌株鉴定

1.5.1 生理生化鉴定、形态学观察 对复筛得到的1株抑菌率为87.1%的拮抗菌株NH-8进行革兰氏染色、接触酶反应、淀粉水解、好氧性试验、明胶液化、耐盐性试验、50 ℃生长等生理生化试验 ^[16-17]。

1.5.2 16S rDNA序列分析鉴定 以拮抗菌株BH-01总DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物F27 （5′-AGAGTITGATCATGGCTCAG-3′） 和R1492（5′-GCTACCTTGTTACGACTT-3′） 进行PCR扩增，反应条件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。将PCR产物检测、回收、连接、转化、阳性克隆，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将菌株的16S rDNA序列与GenBank核酸序列数据库中的序列进行比对，回收、纯化扩增产物后进行测序，利用NCBI数据库的BLAST程序对测序结果进行同源性检索，与GenBank数据进行比对分析。