草果果腐病拮抗内生菌的筛选与初步鉴定
2014-10-23郭建伟郭娟刘艳红杨建秋杨丽芬洪亮杨建
郭建伟+郭娟+刘艳红+杨建秋+杨丽芬+洪亮+杨建
摘要：采用组织破碎、稀释涂布法、对峙培养法，分别从草果（Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire）根、茎、叶中分离果腐病镰刀菌拮抗内生菌。结果表明，分别从草果的根、茎、叶分离出内生细菌13、6、3株，从根、茎、叶分离内生真菌5、1、0株。从草果根、茎、叶分离到的内生细菌、内生真菌数量以及草果果腐病镰刀菌的拮抗内生细菌、拮抗内生真菌数量均呈现依次递减趋势。草果根部存在葡萄球菌属、微球菌属、芽孢杆菌属3类拮抗内生细菌及3株不同属的内生真菌，茎部仅有微球菌属1类拮抗内生细菌。
关键词：镰刀菌；内生真菌；内生细菌
中图分类号：S436.67；Q939.9 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2014）08-0116-02
草果（Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire）为姜科豆蔻属多年生常绿丛生草本植物，主要分布在我国贵州、广西、云南等地，果实性温、浓香，具有健胃、消食、顺气、祛寒湿等药效，是上好的烹调佐料[1]。草果在云南省南部、东南部、西南部地区的亚热带雨林中广泛种植，叶斑病、花腐病、果腐病、立枯病等病害日益严重，常导致果穗腐烂、脱落，果实腐烂，叶片枯死[2-4]。内生菌是指生活史的某一阶段或全部阶段生活在健康植物组织和器官内的真菌、细菌、放线菌，被感染的宿主植物不表现外在症状[5]。利用内生菌的固氮、促生、抗旱、防病等功能，开发微生物菌肥，可替代或减少农药、化肥的使用，改善农业生态系统，保持植物微生态系统的生物多样性，实现农业可持续发展[6]。目前关于利用草果果腐病拮抗内生菌研究鲜见报道。本研究探索草果内生菌的分离方法并筛选拮抗菌株，旨在为草果的优质高产提供潜在的生防菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
草果果腐病镰刀菌（Fusarium sp.）F1、F2均由红河学院云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室提供。牛肉膏蛋白胨培养基（NA）、马铃薯培养基（PDA）、LB液体培养基。
1.2 内生菌分离
1.2.1 样品采集 从云南省红河州金屏县马鞍底乡草果种植区分别采集草果根、茎、叶，置于无菌自封袋内带回实验室。
1.2.2 内生细菌的分离、纯化 将根、茎、叶修剪整齐，分别放入75%乙醇中消毒5 min，再放入10%NaClO中分别消毒8、5、2 min，用无菌水反复浸洗2～3次，最后用无菌滤纸吸干表面水分。分别取5 g样品置于无菌研钵中，加10 mL无菌水研磨，静置50 s，取30 μL分别涂布在LB、PDA平板上，置于28 ℃恒温箱中培养2～3 d，以最后一遍浸洗消毒组织的无菌水涂布上述平板作为对照。待菌落长出后，根据细菌形态、颜色、质地，反复划线纯化，根据真菌菌落形态、颜色、质地及菌丝形态（粗细、气生菌丝是否发达）挑取菌丝转接纯化[7]。
1.3 内生菌对果腐病病原菌的拮抗测定
1.3.1 镰刀菌、内生菌的培养
将镰刀菌、内生真菌接在PDA平板上，25 ℃恒温培养，待菌丝长满平板后转4 ℃冰箱保存备用。将纯化的内生细菌接种于LB培养基上，28 ℃ 160 r/min 振荡培养24 h，4 ℃ 6 000 r/min离心12 min，取沉淀，以无菌水悬浮并调整浓度为106 CFU/mL。
1.3.2 拮抗活性测定
用打孔器取直径为5 mm的病原菌饼于PDA平板中央，用接种环挑取内生细菌悬浮液点接在距平板中央3 cm处的4个角点上，或用打孔器取直径为5 mm的内生真菌点接在距病原菌2～3 cm处的平板右边，以仅接镰刀菌的平板作为对照，每处理设3次重复。28 ℃恒温培养3～ 7 d 后，计算相对抑制率：I=（R0-Ri）/R0×100%。式中：R0代表对照病原菌菌落的扩展半径，Ri代表对峙培养病原菌菌落的扩展半径，I代表相对抑制率。
1.4 拮抗菌株的鉴定
用形态学、生理生化方法初步鉴定内生细菌，用形态学方法初步鉴定内生真菌[8-9]。
2 结果与分析
2.1 草果内生菌的分离
利用涂布平板法，根据菌落的形态、颜色、质地、大小等特征划线纯化，分别从草果的根、茎、叶中分离出内生细菌13、6、3株，共计22株。根据菌落形态、颜色、大小、质地及菌丝形态的不同，分别从根、茎、叶中分离内生真菌5、1、0株，共计6株。从草果根系分离到的内生菌数量及种类远多于茎、叶。
2.2 内生菌对镰刀菌的拮抗活性测定
采用对峙培养法利用PDA培养基筛选出对草果果腐病镰刀菌具有一定拮抗作用的内生细菌5株，占测试内生细菌的22.73%。其中，4株分离自草果根系，1株分离自草果茎。由表1可知，分离自根系的菌株CGGX-09、CGGX-16对草果果腐病有较强的抑制作用。采用对峙培养法利用PDA培养基筛选出拮抗性内生真菌3株，均分离自根系，占测试内生真菌的50%。CGGZ-02 、CGGZ-03、CGGZ-04对草果果腐病的抑菌率分别为31.8%、90.95%、15.0%，菌株CGGZ-03对草果果腐病抑制作用较强。
2.3 拮抗内生菌的鉴定
结合形态学、生理生化分析对拮抗性内生细菌进行鉴定，结果表明：CGGX-09革兰氏反应阴性，球菌，接触酶反应阳性，甲基红反应阴性，淀粉水解反应阴性，可耐受7% NaCl。CGJX-10 革兰氏反应阴性，球菌，接触酶反应阳性，甲基红反应阴性，淀粉水解反应阴性，可耐受7% NaCl。CGGX-11革兰氏反应阳性，杆菌，接触酶反应阳性，甲基红反应阴性，淀粉水解反应阴性，可耐受7% NaCl。CGGX-16革兰氏反应阳性，杆菌，接触酶反应阳性，甲基红反应阴性，淀粉水解反应阴性，可耐受10% NaCl。CGGX-20革兰氏反应阴性，球菌，接触酶反应阳性，甲基红反应阴性，淀粉水解反应阴性，可耐受10% NaCl。参考《常见细菌系统鉴定手册》[8]，可以初步确定菌株CGGX-09为葡萄球菌属，菌株CGJX-10为微球菌属，菌株CGGX-11为芽孢杆菌属，菌株CGGX-16为芽孢杆菌属，菌株CGGX-20为微球菌属。根据内生真菌的菌落形态观察，结合《真菌鉴定手册》[9]，初步确定菌株CGGZ-02为子囊菌纲多腔菌目沙卡氏菌科沙卡氏菌属，菌株 CGGZ-03 为半知菌亚门丛梗孢目青霉属卡地干酪青霉组，菌株 CGGZ-04 为半知菌类无孢菌群丝核菌属（表2）。
3 结论与讨论
3.1 样品组织对内生菌多样性的影响
研究表明，内生菌广泛分布于植物的根、茎、叶、花、果实、种子等器官、组织的细胞或细胞间隙中[10]。石斛内生真菌分布及类群组成具有组织差异性，不同地方的样品内生真菌优势种群也具有差异性[11-12]。本研究从草果根、茎、叶分离到的内生细菌、内生真菌数量以及草果果腐病镰刀菌的拮抗内生细菌、拮抗内生真菌数量均呈现依次递减趋势。草果根部存在葡萄球菌属、微球菌属、芽孢杆菌属3类拮抗内生细菌及3株不同属的内生真菌，茎部仅有微球菌属1类拮抗内生细菌，初步揭示了草果内生菌分布及类群存在着组织差异性。根部内生菌及拮抗菌株较为丰富或许与果腐病镰刀菌是土传病害有关。
3.2 草果内生菌对果腐病镰刀菌的防治
生防菌的田间防效会因物理、化学、微生物种群等因素的影响而降低，因而室内筛选的生防菌尚需盆栽试验进一步验证[13]。内生真菌CGGZ-03经鉴定为青霉属真菌，该菌为多种土壤的优势真菌属，且能分泌丰富的抑菌次生代谢物[14]。张玲琪等从草果病害组织中分离出青霉，但未经回接试验证明为病原菌[2]。该菌株在探索盆栽试验及田间试验前应进行草果接种试验探明其是否具有致病性。
参考文献：
[1]唐德英，马 洁，里 二，等. 我国草果栽培技术研究慨况[J]. 亚太传统医药，2009，5（7）：157-162.
[2]张玲琪，盛玲玲. 草果病害的初步研究[J]. 云南大学学报：自然科学版，1991，13（3）：255-261.
[3]鲁海菊，张云霞，刘 卫，等. 草果叶斑病防治初步研究[J]. 菌物研究，2007，5（3）：169-170，173.
[4]鲁海菊，张云霞，刘 卫，等. 草果疫病初步研究[J]. 云南农业大学学报，2007，22（5）：773-775.
[5]魏宝阳，曹 亮，李顺祥，等. 内生菌与药用植物的关系及对次生代谢产物的影响[J]. 中国农学通报，2011，27（19）：83-88.
[6]石晶盈，陈维信，刘爱媛. 植物内生菌及其防治植物病害的研究进展[J]. 生态学报，2006，26（7）：2395-2401.
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[8]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001.
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[10]宋素琴，欧提库尔·玛合木提，张志东，等. 新疆胀果甘草内生菌的分离和鉴定[J]. 微生物学通报，2007，34（5）：867-870.
[11]胡克兴，侯晓强，郭顺星.铁皮石斛内生真菌分布[J]. 微生物学通报，2010，37（1）：37-42.
[12]洪群艳，董文汉，徐文婷，等. 几种云南野生石斛内生真菌的鉴定及分布[J]. 生物技术进展，2012，2（3）：190-194.
[13]Zou C S，Mo M H，Gu Y Q，et al. Possible contributions of volatile-producing bacteria to soil fungistasis[J]. Soil Biology & Biochemistry，2007，39（9）：2371-2379.
[14]鲁海菊，张晓永，全舒舟，等. 从93株土壤真菌中筛选抑制石榴干腐病菌的活性菌株[J]. 江苏农业科学，2013，41（7）：108-110.
3 结论与讨论
3.1 样品组织对内生菌多样性的影响
研究表明，内生菌广泛分布于植物的根、茎、叶、花、果实、种子等器官、组织的细胞或细胞间隙中[10]。石斛内生真菌分布及类群组成具有组织差异性，不同地方的样品内生真菌优势种群也具有差异性[11-12]。本研究从草果根、茎、叶分离到的内生细菌、内生真菌数量以及草果果腐病镰刀菌的拮抗内生细菌、拮抗内生真菌数量均呈现依次递减趋势。草果根部存在葡萄球菌属、微球菌属、芽孢杆菌属3类拮抗内生细菌及3株不同属的内生真菌，茎部仅有微球菌属1类拮抗内生细菌，初步揭示了草果内生菌分布及类群存在着组织差异性。根部内生菌及拮抗菌株较为丰富或许与果腐病镰刀菌是土传病害有关。
3.2 草果内生菌对果腐病镰刀菌的防治
生防菌的田间防效会因物理、化学、微生物种群等因素的影响而降低，因而室内筛选的生防菌尚需盆栽试验进一步验证[13]。内生真菌CGGZ-03经鉴定为青霉属真菌，该菌为多种土壤的优势真菌属，且能分泌丰富的抑菌次生代谢物[14]。张玲琪等从草果病害组织中分离出青霉，但未经回接试验证明为病原菌[2]。该菌株在探索盆栽试验及田间试验前应进行草果接种试验探明其是否具有致病性。
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