5种常见食用菌液体发酵产物对黄瓜褐斑菌的抑制作用
2014-10-23徐艳王东华纪明山
徐艳+王东华+纪明山
摘要：研究5种食用菌香菇、杏鲍菇、金针菇、猴头菇、鸡腿菇液体发酵产物对黄瓜褐斑菌的抑制作用。通过母种试管活化培养、摇瓶种子培养、摇瓶发酵培养等一系列操作收集发酵产物，最后采用平板法研究各产物对黄瓜褐斑菌的抑制作用。结果表明，各菌种发酵液的抑菌活性明显高于菌丝提取物。其中，以香菇、猴头菇发酵液抑菌活性最好，抑制率达50%以上。猴头菇发酵液的分离纯化结果表明，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的抑菌活性均好于原发酵液，其中乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最好。
关键词：食用菌；液体发酵产物；平板法；黄瓜褐斑菌；抑菌作用
中图分类号：S436.421.1+9 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2014）08-0114-02
黄瓜是日常生活的主要蔬菜，随着保护地黄瓜种植的发展，黄瓜褐斑病逐年加重，已成为保护地黄瓜生产中亟待解决的叶部病害。黄瓜褐斑病是由多主棒孢菌引起的世界性分布的病害。1994年房德纯等报道了该病在辽宁省的发生情况，此后，黄瓜褐斑病在华北、西北的露地和保护地相继发生[1]。近年来，随着黄瓜保护地种植规模的不断扩大，该病害蔓延趋势明显，尤其在2008年，全国各地黄瓜产区普遍有黄瓜褐斑病发生，发病严重地块经济损失在20%以上。在黄瓜褐斑病的防治上，多以百菌清、甲基硫菌灵、福美双等药剂为主，这些常见药剂作为预防药剂，有病无病都在使用，致使褐斑病菌对其不再敏感，病害一旦在田间流行就很难控制，而且化学农药也会造成一定的环境污染，给人类生活和生存带来不利的影响[2]。目前，许多学者从天然植物中筛选农药取得了一定的进展[3-8]，但天然植物受资源限制严重，对生态环境有一定的破坏，而且开发成本较高。我国药食用真菌资源丰富，无毒副作用，从中寻找抑制植物病原菌的活性物质，研制新型杀菌剂以防治植物病害，对栽种符合健康标准的蔬菜具有重要意义。一方面，从药食用真菌中不断发现结构新颖和具有显著生物活性的化合物，这种结构多样性对于新农药的发现有重要意义；另一方面，大型药食用真菌可以较方便地通过菌丝体或孢子发酵培养，实现生产的工业化、规模化，产量高、发酵周期短、生产效益高。这为今后可能产业化生产提供了资源保证，相对于受资源限制的植物源农药而言，这是一个潜在的优势[9]。本研究通过平板法，以香菇（Lentinula edodes）、杏鲍菇（Pleurotus eryngii）、金针菇（Flammulina velutipes）、猴头菇（Hericium erinaceus）、鸡腿菇（Coprinus comaus）等几种常见食用真菌发酵产物为研究对象，分别对黄瓜褐斑菌进行抑菌试验，进而通过生长速率法分别计算各个菌种发酵产物对黄瓜褐斑病菌的抑菌率。结果表明，发酵液的抑菌活性明显高于菌丝提取物。其中，以香菇、猴头菇发酵液抑菌活性最好，抑制率达50%以上。猴头菇发酵液的分离纯化结果表明，乙酸乙酯萃取物抑菌活性最好。
1 材料与方法
1.1 试验菌株
香菇、杏鲍、金针菇、猴头菇和鸡腿菇等供试菌株均由辽宁省农业科学院提供；黄瓜褐斑菌由沈阳农业大学植物保护学院生物农药实验室提供。
1.2 主要试验仪器
恒温电热水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、电热恒温鼓风干燥箱、电子分析天平、恒温振荡箱、超净工作台、电动粉碎机、电冰箱。
1.3 方法
1.3.1 培养基的配制
PDA固体培养基含马铃薯 200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，水1 000 mL。不同菌种的种子培养基与发酵培养基如下。
1.3.1.1 香菇
种子培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，酵母膏20 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 1.5 g。发酵培养基：玉米粉 40 g，酵母膏3 g，蔗糖25 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 1 g，维生素B1 0.05 g，pH值5.25。
1.3.1.2 杏鲍菇
种子培养基：马铃薯200 g，麦麸40 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4 1.5 g。发酵培养基：玉米粉 30 g，麦麸20 g，酵母膏3 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5 g。
1.3.1.3 金针菇
种子培养基：玉米粉50 g，麦麸30 g，酵母膏10 g，蔗糖4 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5 g，维生素B1 0.1 g。发酵培养基：玉米粉30 g，可溶性淀粉20 g，麦麸30 g，蛋白胨10 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5 g，维生素B1 0.1 g。
1.3.1.4 猴头菇
种子培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，酵母膏1 g，KH2PO4 2 g，MgSO4 1 g，维生素B1 0.1 g，pH值6.5。发酵培养基：可溶性淀粉25 g，酵母膏25 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 1 g，维生素B1 0.1 g，pH值5.0。
1.3.1.5 鸡腿菇
种子培养基：蔗糖20 g，酵母粉5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.05 g，维生素B1 0.01 g。发酵培养基：蔗糖20 g，酵母粉5 g，麦麸40 g，玉米粉30 g，KH2PO4 3 g，MgSO4 1 g。培养基每瓶100 mL分装于三角瓶中进行高压灭菌，121 ℃灭菌20 min后置于超净台冷却备用。
1.3.2 菌种的发酵培养
将培养好的种子液按10%的接种量接入发酵培养基中，在27 ℃摇床中培养，待菌丝生长成熟后结束发酵。
1.3.3 各菌种代谢产物对黄瓜褐斑菌的抑制作用
1.3.3.1 菌丝活性成分的提取
收集菌丝，水洗后低温干燥。菌丝加水后超声提取，收集提取液。
1.3.3.2 培养基平板的制备
采用平板法测定各发酵产物的抑菌活性。将灭菌的9 cm直径平皿分为2组，一组为空白对照，一组为加样组。各组均加入10 mL PDA培养基，随后加样组中加入5 mL 发酵液混匀，空白对照组中则加入5 mL 无菌水混匀，静置数分钟待培养基冷凝备用。
1.3.3.3 黄瓜褐斑菌的接种与培养
用已灭菌的打孔器（直径为10 mm）取已活化好的黄瓜褐斑菌饼，小心放入所有制备好的培养基平板中心（确保褐斑菌能均匀的向四周生长）。接种完成后用封口膜将平皿密封好，放入电热恒温鼓风干燥箱中，28 ℃培养 7 d后观察结果。以上操作均在无菌条件下完成。
1.3.4 生长速率法测定抑菌率
待菌落生长一定时间后用十字交叉法测量黄瓜褐斑菌菌落的直径，菌落生长直径（mm）采用3次测量菌落直径平均值，并用下述公式计算抑菌率：
1.3.5 猴头菇发酵液的分离纯化
将猴头菇发酵液放入分液漏斗中，依次用乙酸乙酯、正丁醇分别对发酵液样品进行萃取，每种萃取液重复萃取2 次，分别合并萃取液，将其浓缩，放置在4 ℃冰箱中保存备用。
2 结果与分析
2.1 各菌种发酵产物抑菌试验结果
试验结果表明，菌丝提取物几乎没有抑制作用，几种真菌发酵液对黄瓜褐斑菌都有不同程度的抑制作用，培养数天后菌落的菌斑大小各有不同，表1结果表明，香菇、杏鲍菇、金针菇、猴头菇、鸡腿菇这5种常见的食用真菌发酵液均具有不同程度的抑菌效果。其中，香菇和猴头菇的抑菌率最高，分别为58.8%和60.0%；杏鲍菇和金针菇次之，分别为45.9%和38.8%；鸡腿菇的抑菌率最低，仅为29.4%。
3 结论
本研究所选用的5种真菌均为常见的食用真菌，其发酵方法已较成熟，但其对植物病原生长的抑制活性鲜有报道。本研究结果证明了这5种食用真菌发酵液有一定的抑制黄瓜褐斑菌的活性，由于发酵液只进行了初步纯化，有必要继续对发酵液的活性物质进行研究。研究中所提取的各种活性物质对人、动物和环境没有任何影响，是理想的生物农药前导物，有较大的开发前景。
参考文献：
[1]房德纯，傅俊范. 黄瓜褐斑病病原与发病情况调查研究初报[J]. 植物保护，1994，20（3）：23-24.
[2]许 远，张子君，邹庆道，等. 黄瓜褐斑病的药剂防治研究[J]. 辽宁农业科学，2000，31（6）：47-48.
[3]Eduardo O，Mariano F，Daniel H，et al.Biological efficiency of polyphenolic extracts from pecan nuts shell（Carya illinoensis），pomegranate husk（Punica granatum） and creosote bush leaves（Larrea tridentata Cov.） against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2010，31（1）：153-157.
[4]朱巧萍，高雪平，程 璐，等. 微波辅助提取香榧假种皮挥发油及其对植物病原真菌的抑制活性[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：309-311.
[5]Mahlo S M，Mcgaw L J，Eloff J N. Antifungal activity of leaf extracts from South African trees against plant pathogens[J]. Crop Protection，2010，29（12）：1529-1533.
[6]刘绍雄，王金华，熊 智，等. 青蒿乙醇提取物对5龄思茅松毛虫肠道细菌的抑制作用[J]. 江苏农业科学，2012，40（4）：141-142.
[7]de Rodríguez D J，Hernández-Castillo D，Rodríguez-García R，et al. Antifungal activity in vitro of aloe vera pulp and liquid fraction against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2005，21（1）：81-87.
[8]吴雪平，田雪亮，项志锋. 蓖麻籽水提物对黄瓜褐斑病菌的生物活性研究[J]. 西北农业学报，2006，15（6）：215-216.
[9]杨民宝. 锈革孔菌科三种真菌对植物病原菌抑制作用的研究[D]. 哈尔滨：东北林业大学，2009：1.
1.3.3 各菌种代谢产物对黄瓜褐斑菌的抑制作用
1.3.3.1 菌丝活性成分的提取
收集菌丝，水洗后低温干燥。菌丝加水后超声提取，收集提取液。
1.3.3.2 培养基平板的制备
采用平板法测定各发酵产物的抑菌活性。将灭菌的9 cm直径平皿分为2组，一组为空白对照，一组为加样组。各组均加入10 mL PDA培养基，随后加样组中加入5 mL 发酵液混匀，空白对照组中则加入5 mL 无菌水混匀，静置数分钟待培养基冷凝备用。
1.3.3.3 黄瓜褐斑菌的接种与培养
用已灭菌的打孔器（直径为10 mm）取已活化好的黄瓜褐斑菌饼，小心放入所有制备好的培养基平板中心（确保褐斑菌能均匀的向四周生长）。接种完成后用封口膜将平皿密封好，放入电热恒温鼓风干燥箱中，28 ℃培养 7 d后观察结果。以上操作均在无菌条件下完成。
1.3.4 生长速率法测定抑菌率
待菌落生长一定时间后用十字交叉法测量黄瓜褐斑菌菌落的直径，菌落生长直径（mm）采用3次测量菌落直径平均值，并用下述公式计算抑菌率：
1.3.5 猴头菇发酵液的分离纯化
将猴头菇发酵液放入分液漏斗中，依次用乙酸乙酯、正丁醇分别对发酵液样品进行萃取，每种萃取液重复萃取2 次，分别合并萃取液，将其浓缩，放置在4 ℃冰箱中保存备用。
2 结果与分析
2.1 各菌种发酵产物抑菌试验结果
试验结果表明，菌丝提取物几乎没有抑制作用，几种真菌发酵液对黄瓜褐斑菌都有不同程度的抑制作用，培养数天后菌落的菌斑大小各有不同，表1结果表明，香菇、杏鲍菇、金针菇、猴头菇、鸡腿菇这5种常见的食用真菌发酵液均具有不同程度的抑菌效果。其中，香菇和猴头菇的抑菌率最高，分别为58.8%和60.0%；杏鲍菇和金针菇次之，分别为45.9%和38.8%；鸡腿菇的抑菌率最低，仅为29.4%。
3 结论
本研究所选用的5种真菌均为常见的食用真菌，其发酵方法已较成熟，但其对植物病原生长的抑制活性鲜有报道。本研究结果证明了这5种食用真菌发酵液有一定的抑制黄瓜褐斑菌的活性，由于发酵液只进行了初步纯化，有必要继续对发酵液的活性物质进行研究。研究中所提取的各种活性物质对人、动物和环境没有任何影响，是理想的生物农药前导物，有较大的开发前景。
参考文献：
[1]房德纯，傅俊范. 黄瓜褐斑病病原与发病情况调查研究初报[J]. 植物保护，1994，20（3）：23-24.
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[9]杨民宝. 锈革孔菌科三种真菌对植物病原菌抑制作用的研究[D]. 哈尔滨：东北林业大学，2009：1.
1.3.3 各菌种代谢产物对黄瓜褐斑菌的抑制作用
1.3.3.1 菌丝活性成分的提取
收集菌丝，水洗后低温干燥。菌丝加水后超声提取，收集提取液。
1.3.3.2 培养基平板的制备
采用平板法测定各发酵产物的抑菌活性。将灭菌的9 cm直径平皿分为2组，一组为空白对照，一组为加样组。各组均加入10 mL PDA培养基，随后加样组中加入5 mL 发酵液混匀，空白对照组中则加入5 mL 无菌水混匀，静置数分钟待培养基冷凝备用。
1.3.3.3 黄瓜褐斑菌的接种与培养
用已灭菌的打孔器（直径为10 mm）取已活化好的黄瓜褐斑菌饼，小心放入所有制备好的培养基平板中心（确保褐斑菌能均匀的向四周生长）。接种完成后用封口膜将平皿密封好，放入电热恒温鼓风干燥箱中，28 ℃培养 7 d后观察结果。以上操作均在无菌条件下完成。
1.3.4 生长速率法测定抑菌率
待菌落生长一定时间后用十字交叉法测量黄瓜褐斑菌菌落的直径，菌落生长直径（mm）采用3次测量菌落直径平均值，并用下述公式计算抑菌率：
1.3.5 猴头菇发酵液的分离纯化
将猴头菇发酵液放入分液漏斗中，依次用乙酸乙酯、正丁醇分别对发酵液样品进行萃取，每种萃取液重复萃取2 次，分别合并萃取液，将其浓缩，放置在4 ℃冰箱中保存备用。
2 结果与分析
2.1 各菌种发酵产物抑菌试验结果
试验结果表明，菌丝提取物几乎没有抑制作用，几种真菌发酵液对黄瓜褐斑菌都有不同程度的抑制作用，培养数天后菌落的菌斑大小各有不同，表1结果表明，香菇、杏鲍菇、金针菇、猴头菇、鸡腿菇这5种常见的食用真菌发酵液均具有不同程度的抑菌效果。其中，香菇和猴头菇的抑菌率最高，分别为58.8%和60.0%；杏鲍菇和金针菇次之，分别为45.9%和38.8%；鸡腿菇的抑菌率最低，仅为29.4%。
3 结论
本研究所选用的5种真菌均为常见的食用真菌，其发酵方法已较成熟，但其对植物病原生长的抑制活性鲜有报道。本研究结果证明了这5种食用真菌发酵液有一定的抑制黄瓜褐斑菌的活性，由于发酵液只进行了初步纯化，有必要继续对发酵液的活性物质进行研究。研究中所提取的各种活性物质对人、动物和环境没有任何影响，是理想的生物农药前导物，有较大的开发前景。
参考文献：
[1]房德纯，傅俊范. 黄瓜褐斑病病原与发病情况调查研究初报[J]. 植物保护，1994，20（3）：23-24.
[2]许 远，张子君，邹庆道，等. 黄瓜褐斑病的药剂防治研究[J]. 辽宁农业科学，2000，31（6）：47-48.
[3]Eduardo O，Mariano F，Daniel H，et al.Biological efficiency of polyphenolic extracts from pecan nuts shell（Carya illinoensis），pomegranate husk（Punica granatum） and creosote bush leaves（Larrea tridentata Cov.） against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2010，31（1）：153-157.
[4]朱巧萍，高雪平，程 璐，等. 微波辅助提取香榧假种皮挥发油及其对植物病原真菌的抑制活性[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：309-311.
[5]Mahlo S M，Mcgaw L J，Eloff J N. Antifungal activity of leaf extracts from South African trees against plant pathogens[J]. Crop Protection，2010，29（12）：1529-1533.
[6]刘绍雄，王金华，熊 智，等. 青蒿乙醇提取物对5龄思茅松毛虫肠道细菌的抑制作用[J]. 江苏农业科学，2012，40（4）：141-142.
[7]de Rodríguez D J，Hernández-Castillo D，Rodríguez-García R，et al. Antifungal activity in vitro of aloe vera pulp and liquid fraction against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2005，21（1）：81-87.
[8]吴雪平，田雪亮，项志锋. 蓖麻籽水提物对黄瓜褐斑病菌的生物活性研究[J]. 西北农业学报，2006，15（6）：215-216.
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