铬胁迫对烟草叶片叶绿素荧光特性和活性氧代谢系统的影响

吴敏兰+贾洋洋+李荭荭+杨林通+王果

摘要：以福建省主栽烟草品种翠碧1号、K326和云烟87为材料，采用土培方法研究了铬（Cr）胁迫对烟草叶绿素荧光特性和活性氧代谢系统的影响。结果表明，以吸收光能为基础的总性能指数PIABS呈显著下降趋势，Cr胁迫首先影响了PSⅡ对光能的吸收和电子传递，降低PSⅡ反应中心活性，引起了发生在从PSⅡ供体侧（即OEC）到PSI末端电子受体还原整个光合电子传递链的光抑制伤害；铬添加量为30、60、90 mg/kg时，3种烟草叶绿素荧光诱导动力学曲线（O-J-I-P曲线）初始值与对照相比差异不大，未出现明显的K点；当铬添加量为90 mg/kg时，J-I-P段荧光值显著下降；低Cr添加量对烟草叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性有促进作用，高添加量则表现为抑制作用；烟草叶片过氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）含量随Cr添加量的增加呈明显上升趋势，表明高浓度Cr胁迫对烟草叶片膜脂系统造成了氧化损伤，并超出了细胞内部的活性氧清除能力。铬对3个烟草品种的影响无显著差异。

关键词：Cr胁迫；烟草；安全生产；叶绿素荧光特性；活性氧代谢系统

中图分类号：S572.01；Q945.78 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0092-04

高等植物的光合作用常受到各种不利环境因素的影响，重金属污染就是其中因素之一^[1]。Cr是土壤中毒性很强的重金属污染物，土壤铬污染、农产品铬超标及其安全性问题已受到国内外广泛关注^[2]。叶绿素荧光技术是近年来在光合作用机理研究中发展的一种新型、快速、简便、准确、无损伤的检测植物光合作用生理状况的新技术，它包含了十分丰富的光合作用过程变化的信息，被认为植物光合作用与环境关系的内在探针，是研究植物逆境胁迫的可靠而有效的工具^[3-5]。

烟草是我国主要的经济作物之一，其商品价值主要取决于烟叶的品质。翠碧1号、K326和云烟87为福建省烤烟主栽品种^[6]。虽然已有不少关于土壤Cr污染对植物的影响的研究^[7-9]，但关于土壤Cr污染对烟草的影响的研究较少。已有的关于烟草的研究主要涉及Cr污染对组培苗、种子的影响^[10-12]，尚未见关于土壤Cr污染对不同生长期烟草生理生化的影响的研究。本试验研究了不同浓度Cr胁迫下3种烟草品种超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）和叶绿素荧光参数变化，探讨不同浓度Cr胁迫对烟草叶绿素荧光参数以及活性氧代谢系统的影响，以期为烟草安全生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烟草品种为翠碧1号、K326、云烟87。

供试土壤采自闽侯县的农田表层。土壤基本理化性质如下：pH值4.84，CEC值（阳离子交换量）为12.13 cmol/kg，有机质含量11.32 g/kg，黏粒43，35%，粉粒31.49%，沙粒25.15%。

1.2 方法

1.2.1 土培试验

土培试验在福建农林大学资源与环境学院盆栽房内进行。每盆装风干土9 kg，一次性施入重铬酸钾（K2Cr2O7），各处理Cr添加浓度分别为0（CK）、30、60、90 mg/kg，每处理重复3次。同时每盆施入烟草专用肥2.94 g，钙镁磷肥0.70 g。烟草幼苗由福建省烟科所培育，当幼苗生长到2～3片真叶时，移栽到已装土的塑料盆中，每盆1株。移栽后的管理同一般大田生产。

移栽85 d后，于2012年6月26日取样。取中部相同叶位的叶片用面积为0.608 cm2的打孔器打孔取样，样品装入锡箔袋中，密封，迅速放入液氮中，带回实验室置于-86 ℃超低温冷冻存储箱，备用。

1.2.2 叶绿素荧光参数测定

于2012年6月25日夜间，在各植株中部选取相同部位同一方向且长势相同的无病虫害叶片，用 Handy PEA植物效率仪（英国Hansatech公司）测定叶绿素荧光参数。准确记录叶绿素荧光诱导动力学曲线的快相部分，完整测定叶绿素的O-J-I-P荧光诱导曲线。主要测定Fo（初始荧光）、Fm（最大荧光）、Fv、Fv/Fm（PSⅡ原初光能转化效率）、PIABS等多个荧光参数。

1.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定

采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定。取3片小圆叶片，加入1.6 mL提取液（0.5 mol/L pH值7.8的磷酸缓冲液、0.1 mol/L EDTA、0.5% Triton），冰浴充分研磨，于4 ℃下12 000 r/min离心20 min，取上清液备用。SOD活性按Giannopolitis和Rice（1977年）的方法略作修改：反应液为0.05 mol/L磷酸缓冲液、130 mmol/L Met溶液、750 μmol/L NBT、100 μmol/L EDTA液。取（1）上清液50 μL+3.85 mL反应液+100 μL核黄素溶液；（2）提取液50 μL+3.85 mL反应液+100 μL核黄素溶液；（3）上清液50 μL+3.85 mL反应液+100 μL核黄素溶液。（1）、（2）在12 000 lx光照强度下反应25 min，以（3）不照光为对照。用岛津UV-1750双光束紫外可见分光光度计测定560 nm 吸光度，并计算SOD活性，以抑制NBT光化还原50%为1个酶活单位（U）。

1.2.4 过氧化物酶（POD）活性测定

采用愈创木酚法，酶液提液方法同SOD活性测定。反应混合液为50 mmol/L磷酸缓冲液（pH值6.0）、50 mmol/L愈创木酚、2%过氧化氢、H2O混合均匀。取比色皿加入990 μL反应混合液+10 μL酶液快速混匀，立即开启秒表，于分光光度计470 nm波长下测吸光度，3 min后再读数1次。以1 min内D470 nm变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）。

1.2.5 丙二醇（MDA）含量测定

采用双波长硫代巴比妥酸法（TBA）法，按史树德改进的方法^[13]略作修改：取3片小圆叶片加入1.6 mL 5%三氯乙酸（TCA）提取液，研磨至匀浆，匀浆在4 000 r/min离心10 min。吸取离心的上清液0.8 mL，加入0.8 mL硫代巴比妥酸法（TBA）溶液，摇匀，放入沸水浴中煮沸10 min，取出并冷却，4 000 r/min离心10 min，取上清液用岛津UV-1750双光束紫外可见分光光度计测定450、532、600 nm的吸光度，并计算MDA含量（μmol/m2）。

1.3 数据分析

试验数据的处理和分析采用DPS和Sigmaplot软件。

2 结果与分析

2.1 土壤Cr对叶片叶绿素荧光参数的影响

2.1.1 Cr胁迫对叶片叶绿素荧光参数PIABS的影响

高等植物的光合作用是在叶绿体内进行的，大多数光合色素都存在于捕光天线的外围色素蛋白（PSⅠ）之中。色素分子由于吸收光量子转化为激态，从外围的天线系统传递到更接近反应中心（RC）的光系统Ⅱ（PSⅡ）。室温下绝大多数叶绿素荧光都来自PSⅡ。Fv/Fm为开放的PSⅡ反应中心捕获激发能的效率，Fv/Fm的变化代表PSⅡ光化学效率的变化，而以吸收光能为基础的性能指数PIABS可以更为准确地反映植物光合机构的状态^[14]，是光抑制程度的一个重要指标，其比值越高表明光抑制的程度越低，是研究植物胁迫的重要参数。由图1可知，随着Cr胁迫浓度的升高，烟草PIABS呈下降趋势。翠碧1 号CK处理叶片的PIABS为1.199 0，90 mg/kg Cr处理叶片为0.612 7，仅为对照的51.10%，显著低于CK处理。K326对照PIABS为1.197 7，Cr添加浓度60、90 mg/kg处理叶片PIABS分别为对照的56.0%、26.38%，说明当土壤Cr浓度升高时，光合反应中心的活性显著下降。当Cr添加浓度为 0（CK）、30 mg/kg 时，云烟87叶片的PIABS分别为1.083 3、0.925 7；当Cr添加浓度为90 mg/kg时，叶片的PIABS已低至0.657 3，为对照的60.7%。云烟87较翠碧1号和K326下降幅度较小。上述结果表明，在Cr胁迫下，烟草叶片光合反应中心的活性显著下降。

2.1.2 土壤Cr对叶片叶绿素荧光诱导动力学曲线（O-J-I-P曲线）的影响

叶绿素荧光诱导动力学曲线反映了光合电子传递链的传递情况，有4个重要的拐点，即O-J-I-P拐点，分别为（1）O（20～50 μs），说明植物光系统（PSⅠ）释放的荧光量可以理解为PSⅠ的光合效率；（2）J（2×103 μs），指示光反应中电子受体的氧化情况；（3）I（3×104 μs时的荧光强度值）；（4）P（3～105 μs），为最大荧光值。I和P阶段反映光驱动下氧化铁还原蛋白情况^[14-15]。图2、图3、图4分别为翠碧1号、K326和云烟87不同浓度Cr胁迫下O-J-I-P曲线的变化情况。Cr添加量为0 mg/kg（对照）时，为标准的叶绿素荧光诱导曲线。由图2可见，与对照相比，30、60、90 mg/kg 胁迫下O-J-I-P曲线形状变化不大，尤其是起始部分的影响不大，说明此时荧光值升高是因为电子传递受阻，而并非天线色素细胞或放氧复合体被破坏^[16]，这与张谧等对沙冬青的研究^[14]相类似。在Cr最高浓度90 mg/kg胁迫下，翠碧1号、K326和云烟87J-I-P段荧光值显著下降。由此可见，在90 mg/kg浓度胁迫下，翠碧1号、K326和云烟87的光合电子传递链的传递已受到显著影响。

2.2 土壤Cr胁迫对烟草叶片膜系统和酶活性影响

从图5可看出，翠碧1号和云烟87经不同浓度Cr胁迫后，低浓度Cr对烟草叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性有促进作用，高浓度则表现为抑制作用。在Cr添加量为60 mg/kg时，翠碧1号SOD活性上升了6.38%（相当于对照处理）；在Cr添加量为30 mg/kg时，云烟87 SOD活性上升了9.90%；在Cr添加量为90 mg/kg时，翠碧1号SOD活性下降了3.25%，云烟87 SOD活性下降了19.65%；而K326在不同浓度Cr胁迫下SOD活性一直呈现下降趋势，60、90 mg/kg胁迫下，SOD活性分别下降了27.91%、28.73%。

过氧化物酶（POD）是植物细胞中活性较高的一种酶，与光合作用、生长素的氧化和呼吸作用都有关系。在Cr胁迫条件下，烟草叶片的过氧化物酶（POD）活性随Cr添加量的增加呈明显的上升趋势（图6）。在Cr添加量为30 mg/kg时，翠碧1号叶片的POD活性升高，云烟87降低，均与对照没有显著差别，但当Cr添加量为60 mg/kg时，其POD活性与对照有极显著差别（P<0.01）。当Cr添加量为90 mg/kg时，K326叶片POD活性与对照相比上升了17.26 U/m2，但无显著差异（P>0.05）。

供试烟草叶片丙二醛（MDA）含量随Cr添加量的增加而升高，Cr添加量愈大升高愈快（图7）。当Cr添加量为 60 mg/kg 时，翠碧1号、K326和云烟87的MDA含量分别比对照上升76.07%、23.90%和89.38%；而当Cr添加量为 90 mg/kg 时则分别上升了155.50%、89.51%和102.58%。这说明Cr胁迫超过一定浓度后，细胞膜受到破坏，产生了大量的MDA，这与石贵玉等的研究结果^[10]是一致的。丙二醛（MDA）是植物受到逆境胁迫时膜脂过氧化作用的最终产物，其含量的高低和膜质透性同时反映ROS对植物细胞膜伤害的程度。

3 讨论

叶绿素荧光与光合作用中各个反应过程紧密相关，任何逆境对光合作用的影响都可通过叶绿素荧光诱导动力学参数的变化反映出来^[17-18]。本研究指标参数Fv/Fm、PIABS和叶绿素荧光诱导动力学曲线均反映了植物叶片光合系统Ⅱ对光能的吸收和利用情况。参数Fv/Fm和PIABS是光抑制程度的重要指标。本研究结果表明，随着Cr胁迫浓度升高，3种烟草Fv/Fm和PIABS均呈下降趋势，烟草叶片光能吸收利用效率下降，均受到光抑制。可见Cr胁迫首先影响了烟草叶片PSⅡ对光能的吸收和电子传递，进而降低了PSⅡ反应中心活性，使光合机构及活性中心受损。

叶绿素荧光诱导动力学曲线包含着大量关于PSⅡ供体侧、受体侧以及反应中心的信息，当PSⅡ受体侧受到伤害时，荧光诱导动力学曲线上300 μs处叶绿素荧光强度就会上升，出现明显的K点，K点的出现表明电子从PSⅡ供体侧的放氧复合体（OEC）到Yz的电子传递受到抑制，常被用作OEC受伤害的标志，此时O-J-I-P变为O-K-J-I-P^[19]。本研究结果显示，Cr胁迫对翠碧1号、K326和云烟87叶绿素荧光诱导动力学曲线（O-J-I-P）起始部分的影响不大，最高浓度90 mg/kg胁迫下，J-I-P段荧光值显著下降，光合电子传递链的传递已受到显著影响，PSⅡ反应中心活性受到明显抑制，但与CK相比均没有明显的K点出现，表明Cr胁迫下烟草叶片PSⅡ活性受到抑制，而供体侧OEC没有受到伤害，意味着烟草叶片OEC对Cr胁迫并不敏感，有较高的稳定性。

植物在长期的系统进化过程中，细胞内形成了防御活性氧、自由基毒害的保护机制。当烟草受到Cr6+胁迫时，细胞内启动了包括超氧化物歧化酶、过氧化物酶等的保护酶系统^[20-21]。SOD是植物活性氧酶促清除系统中的关键酶，可催化超氧阴离子歧化成H2O和O2。本研究中，低浓度Cr对烟草叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性有促进作用，高浓度则表现为抑制作用，呈现先促后抑的趋势。低浓度Cr胁迫下，烟草体内活性氧大量增加，导致酶系统分泌更多的酶，SOD清除超氧离子，POD清除SOD产生的H2O，此时SOD和 POD活性均上升，显示出低浓度Cr胁迫对二者的促进作用。这与宋威等对烟草种子铬处理的结果^[12]一致。当Cr胁迫继续增强，SOD活性开始下降，说明烟草SOD酶活性对Cr胁迫具有浓度效应。尽管POD活性仍然保持上升趋势，但活性氧（ROS）清除能力大大削弱，从而造成ROS积累^[19]，致使膜脂过氧化，膜透性增加，抑制植物生长发育。翠碧1号、K326和云烟87在Cr胁迫下叶片中MDA含量明显提高，说明Cr胁迫对烟草叶片膜系统造成了明显伤害，而这种伤害可能与SOD酶活性下降、ROS的积累有关，而ROS的积累可能是烟草叶片光抑制的原因^[19]。

植物的生长发育离不开铬（Cr），铬的不足会导致作物生长受抑制，但过量的铬也会使作物受到毒害。一般认为，低浓度的金属对烟草生长有利，高浓度则对烟草生长有抑制作用^[22]。Parr等研究认为，低浓度的Cr会促进烟草的生长，高浓度的Cr则可抑制烟叶生长^[23]。宋威等的研究也表明铬能抑制烟草的生长和光合作用^[8]。综上所述，本研究中土壤Cr胁迫已经对烟草翠碧1号、K326和云烟87的光系统电子传递和活性氧代谢系统造成严重损伤，从而抑制了烟草正常的生长发育；铬对3个烟草品种的影响无显著差异。

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