一种大片段cDNA克隆的新方法

孙海燕+罗兵

摘要：介绍了一种新的扩增大片段cDNA序列的方法。采用RT-PCR和基因组PCR相结合的方法，分段扩增基因的编码区，然后再通过重叠延伸PCR拼接出基因的全长序列。虽然在确定基因表达的前提下，也可不通过 RT-PCR，直接利用基因组PCR和重叠延伸PCR相结合的方法获得靶基因的全长，但是利用重叠延伸PCR克隆大片段cDNA原理更简单，效率更高，价格更低，因此具有广泛的应用前景。

关键词：水稻；大片段cDNA；重叠延伸PCR

中图分类号：S511.2+20.1 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0051-02

分离和克隆基因是研究基因功能的基础。利用生物信息学方法预测编码基因，通常是通过RT-PCR的方法，获得基因全长。但是，某些基因由于片段过长，在RT-PCR过程中，可能由于mRNA二级结构或反转录酶延伸效率的影响，难以获得cDNA全长^[1-3]。在本研究中，以水稻的UDP-N-乙酰葡萄糖胺酰基转移酶基因（OsLpxA）为例，详细介绍一种新的扩增大片段cDNA序列的方法。水稻OsLpxA基因的cDNA总长度为7 181 bp，采用RT-PCR和基因组PCR相结合的方法，先分段扩增基因的编码区，然后通过重叠延伸PCR将各片段连接起来，获得基因的全长序列^[4-5]。经试验验证，利用重叠延伸PCR克隆靶基因是一种实用且高效的获得大片段cDNA的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 水稻材料 粳稻（Oryza sativa L. Subsp. japonica）品种为日本晴，由常熟市农业科学研究所提供。取样部位为孕穗期的小穗，样品保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.1.2 质粒、菌株和试剂。大肠杆菌DH5α由常熟理工·端木银熙水稻育种中心保存；质粒pCAMBIA1300由华中农业大学生物质能实验室提供；反转录酶、cDNA合成试剂盒和其他分子生物学试剂均购自宝生物工程大连有限公司；引物由上海生工生物公司合成。引物序列见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 水稻OsLpxA基因的分段克隆 根据网站http：//rice.plantbiology.msu.edu/公布的水稻基因组序列，OsLpxA基因一共由8 687个碱基对组成，包括7个外显子和6个内含子（图1）。按照模板链从5′到3′的顺序，7个外显子的长度分别为202 bp、140 bp、441 bp、360 bp、179 bp、3 270 bp和2 589 bp，cDNA总长度为7 181 bp。由于cDNA比较大，不容易通过RT-PCR获得全长，因此采用分段合成的方法，然后再通过重叠延伸PCR获得OsLpxA基因的全长。分段克隆的具体方案如下：（1）F1片段的克隆。OsLpxA基因的前5个外显子都比较小，总长在1 322 bp，我们将这5个外显子组成的 cDNA 序列定义为F1片段，由于F1片段位于基因的5′端，容易通过RT-PCR获得。以mRNA为模板，以1S和1A为引物，经RT-PCR合成得到F1片段。（2）F2片段的克隆。第6个外显子全长3 270 bp，定义为F2片段。直接以基因组DNA为模板，以2S和2A为引物，通过常规PCR扩增，得到F2片段。（3）F3片段的克隆。第7个外显子全长2 589 bp，定义为F3片段。以基因组DNA为模板，以3S和3A为引物，通过PCR扩增，得到F3片段。3对引物在基因上的具体位置如图1。

1.2.2 水稻OsLpxA基因全长的拼接 通过重叠延伸PCR将F1片段、F2片段和F3片段连接起来。具体方案如下：（1）设计引物：3对引物1S和O1A、O2S和O2A、O3S和3A在片段中的具体位置如图2，引物O1A和O2S各包含F1片段3′端后12个碱基和F2片段5′端前12个碱基，引物O2A和O3S各包含F2片段3′端后12个碱基和F3片段5′端前12个碱基。（2）PCR扩增：分别以1S和O1A、O2S和O2A、O3S和3A为引物，以F1片段、F2片段和F3片段为模板，PCR扩增得到F4片段、F5片段和F6片段。由于F4片段的3′端和F5片段的5′端、F5片段的3′端和F6片段的5′端各具有相互重叠的一段序列，可以通过重叠延伸PCR拼接出基因全长。以1S和3A为引物，以F4、F5和F6片段的混合物为模板，通过重叠延伸PCR，获得OsLpxA基因全长（图2）。

1.2.3 全长OsLpxA基因的克隆与测序 基因全长的PCR产物用XbaⅠ酶切后，与经XbaⅠ和SmaⅠ双酶切的载体相连，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆测序。

2 结果

2.1 F1片段的克隆

取液氮保存的水稻幼穗提取总RNA，以反转录后的 cDNA 为模板，以1S和1A为引物，PCR扩增出的F1片段长度为1 322 bp，与预期结果相符（图3-A）。

2.2 F2和F3片段的克隆

以水稻基因组DNA为模板，分别以2S和2A、3S和3A为引物，通过PCR扩增出，获得F2和F3片段的长度分别为 3 270 bp （图3-B）和2 568 bp（图3-C），与预期结果相符。

2.3 水稻OsLpxA的cDNA全长的克隆

分别以F1、F2和F3片段为模板，以1S和O1A、O2S和O2A、O3S和3A为引物，进行PCR扩增。然后，将得到的3种PCR产物混合为模板，以1S和3A为引物，通过重叠延伸PCR扩增出7 181 bp的片段（图3-D），该片段大小与预期结果相符。通过对获得的长片段进行序列分析，发现有99.9%的碱基与已知基因相同，表明该序列为OsLpxA基因。

3 讨论

对已知碱基序列基因的克隆，通常的做法是将mRNA反转录成cDNA，然后通过常规PCR一次性获得基因的全长。作者曾反复试验，利用1S和3A两个端头引物，以mRNA为模板，欲经RT-PCR直接获得OsLpxA基因的全长，但是没有成功。可能的原因有：（1）mRNA存在复杂二级结构，使反转录脱落^[1-3]。

本研究采用RT-PCR和基因组PCR相结合的方法，分段克隆基因，再通过重叠延伸PCR，获得基因的全长。这种方法较好地解决了因基因过大难以获得全长的问题，大大提高了大片段cDNA克隆的成功效率。此外，在确定基因表达的前提下，也可不通过RT-PCR，直接利用基因组PCR和重叠延伸PCR相结合的方法，获得靶基因的全长。

本研究表明，利用重叠延伸PCR克隆大片段cDNA，几乎可用于任何已知序列基因的全长cDNA克隆。因此，本方法在重组DNA领域具有重要的应用价值。

参考文献：

[1]Fan X，Xu Y，Bisceglie A M. Efficient amplification and cloning of near full-length hepatitis C virus genome from clinical samples[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，346（4）：1163-1172.

[2]Sahdev S，Saini S，Tiwari P，et al. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design，enhancers and modified PCR cycle conditions[J]. Molecular and Cellular Probes，2007，21（4）：303-307.

[3]Spiess A N，Lvell R. A highly efficient method for long-chain cDNA synthesis using trehalose and betaine[J]. Analytical Biochemistry，2002，301（2）：168-174.

[4]Bryksin A V，Matsumura I. Overlap extension PCR cloning：a simple and reliable way to create recombinant plasmids[J]. BioTechniques，2010，48（6）：463-465.

[5]苏 燕，邵 国，高嵩单，等. 一种简便高效利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的方法[J]. 包头医学院学报，2007，23（6）：559-560.

对已知碱基序列基因的克隆，通常的做法是将mRNA反转录成cDNA，然后通过常规PCR一次性获得基因的全长。作者曾反复试验，利用1S和3A两个端头引物，以mRNA为模板，欲经RT-PCR直接获得OsLpxA基因的全长，但是没有成功。可能的原因有：（1）mRNA存在复杂二级结构，使反转录脱落^[1-3]。

本研究采用RT-PCR和基因组PCR相结合的方法，分段克隆基因，再通过重叠延伸PCR，获得基因的全长。这种方法较好地解决了因基因过大难以获得全长的问题，大大提高了大片段cDNA克隆的成功效率。此外，在确定基因表达的前提下，也可不通过RT-PCR，直接利用基因组PCR和重叠延伸PCR相结合的方法，获得靶基因的全长。

本研究表明，利用重叠延伸PCR克隆大片段cDNA，几乎可用于任何已知序列基因的全长cDNA克隆。因此，本方法在重组DNA领域具有重要的应用价值。

参考文献：

[1]Fan X，Xu Y，Bisceglie A M. Efficient amplification and cloning of near full-length hepatitis C virus genome from clinical samples[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，346（4）：1163-1172.

[2]Sahdev S，Saini S，Tiwari P，et al. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design，enhancers and modified PCR cycle conditions[J]. Molecular and Cellular Probes，2007，21（4）：303-307.

[3]Spiess A N，Lvell R. A highly efficient method for long-chain cDNA synthesis using trehalose and betaine[J]. Analytical Biochemistry，2002，301（2）：168-174.

[4]Bryksin A V，Matsumura I. Overlap extension PCR cloning：a simple and reliable way to create recombinant plasmids[J]. BioTechniques，2010，48（6）：463-465.

[5]苏 燕，邵 国，高嵩单，等. 一种简便高效利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的方法[J]. 包头医学院学报，2007，23（6）：559-560.

对已知碱基序列基因的克隆，通常的做法是将mRNA反转录成cDNA，然后通过常规PCR一次性获得基因的全长。作者曾反复试验，利用1S和3A两个端头引物，以mRNA为模板，欲经RT-PCR直接获得OsLpxA基因的全长，但是没有成功。可能的原因有：（1）mRNA存在复杂二级结构，使反转录脱落^[1-3]。

本研究采用RT-PCR和基因组PCR相结合的方法，分段克隆基因，再通过重叠延伸PCR，获得基因的全长。这种方法较好地解决了因基因过大难以获得全长的问题，大大提高了大片段cDNA克隆的成功效率。此外，在确定基因表达的前提下，也可不通过RT-PCR，直接利用基因组PCR和重叠延伸PCR相结合的方法，获得靶基因的全长。

本研究表明，利用重叠延伸PCR克隆大片段cDNA，几乎可用于任何已知序列基因的全长cDNA克隆。因此，本方法在重组DNA领域具有重要的应用价值。

参考文献：

[1]Fan X，Xu Y，Bisceglie A M. Efficient amplification and cloning of near full-length hepatitis C virus genome from clinical samples[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，346（4）：1163-1172.

[2]Sahdev S，Saini S，Tiwari P，et al. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design，enhancers and modified PCR cycle conditions[J]. Molecular and Cellular Probes，2007，21（4）：303-307.

[3]Spiess A N，Lvell R. A highly efficient method for long-chain cDNA synthesis using trehalose and betaine[J]. Analytical Biochemistry，2002，301（2）：168-174.

[4]Bryksin A V，Matsumura I. Overlap extension PCR cloning：a simple and reliable way to create recombinant plasmids[J]. BioTechniques，2010，48（6）：463-465.

[5]苏 燕，邵 国，高嵩单，等. 一种简便高效利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的方法[J]. 包头医学院学报，2007，23（6）：559-560.