沙地云杉ISSR—PCR反应体系的初步优化

郑舒文+田有亮+白玉娥+何炎红

摘要：以沙地云杉叶基因组DNA为材料，采用单因素试验方法对ISSR-PCR体系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度、退火温度进行筛选，建立并优化沙地ISSR-PCR反应体系。结果表明，UBC835是最适引物，适宜退火温度为50 ℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最适反应体系（20 μL PCR反应体系）为：2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25 μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，40个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

关键词：沙地云杉；叶基因组DNA；ISSR-PCR；优化

中图分类号：S791.180.1 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0048-03

沙地云杉（Picea mongolica）是中国稀有珍贵树种，集中成片地分布在生态环境恶劣的内蒙古自治区以克什克腾旗的白音敖包自然保护区，形成了罕见的沙地森林。沙地云杉具有耐旱抗寒、防风阻沙、调节气候等特点，并且生存年代久远，所以被称为沙漠上的“绿宝石”和“生物活化石”^[1]。自引种到辽宁、北京、呼和浩特成功之后^[2]，沙地云杉不再是内蒙古草原的特有树种。目前，沙地云杉的研究仍停滞在生态学水平，对其遗传多样性的研究尚未见报道。

简单重复序列间区标记技术（inter-simple sequence repeat，ISSR）是由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994年发展起来的一种微卫星的分子标记^[3]。ISSR标记呈孟德尔式遗传，大部分ISSR标记为显性标记。它结合了SSR和RAPD的优点^[4]，具有模板 DNA用量少、质量要求低，扩增产物特异性强，重复性高，试验操作简便，费用较低等特点，又比RFLP、RAPD、SSR能更多地提供遗传信息，已被广泛应用于品种鉴定、遗传多样性、系统进化关系、遗传作图、基因定位、标记辅助选择^[5]等研究，通过遗传多样性手段对沙地云杉作进一步研究。本试验以沙地云杉叶基因组为模板DNA，分析引物、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶浓度、退火温度对ISSR-PCR扩增的影响，建立适合沙地云杉ISSR-PCR的反应体系，为研究沙地云杉的系统进化、物种鉴定和种间杂交育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 试验材料来自内蒙古浑善达克沙地，种子于40 ℃烘箱中烘干后取出，浸于75%甲醇中一段时间，然后放在培养箱中培养。将长出的嫩叶放入-80 ℃保存，以备取用。

1.1.2 试剂 提取基因组DNA：CTAB提取液，β-巯基乙醇，1×TE缓冲液。引物参照哥伦比亚大学（University of British Columbia，UBC）公布的ISSR引物序列，由北京华大基因有限公司合成。本试验反应体系优化试验固定引物UBC 835的序列为：AGAGAGAGAGAGAGAGC。用于ISSR-PCR的试剂：dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、DNA Marker（DL2000）购自天根（TIANGEN）生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 本试验采用CTAB法提取沙地云杉基因组DNA。

1.2.2 DNA浓度及纯度检测 用紫外分光光度计测定DNA样品在260 nm和280 nm处的吸光度，检测其浓度和纯度。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量并进行PCR扩增，最后稀释至50 ng/μL保存在-20 ℃中备用。

1.2.3 PCR单因素试验 单因素试验是其他因子保持不变，其中1个因子按照一定浓度梯度变化，从而筛选出各因子适合继续优化的最适浓度。本试验是为了筛选出适合于沙地云杉ISSR-PCR反应体系的各因素最佳浓度。不同因素浓度水平见表1。

1.2.4 PCR反应条件 94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，UBC 835的退火温度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40个循环，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存备用。

1.2.5 扩增产物检测 1.2%的琼脂糖凝胶在0.5 ×TBE缓冲液中电泳检测，用UVP凝胶成像系统照相保存。

2 结果与分析

2.1 引物浓度的优化

引物浓度是影响PCR结果的重要变量之一。浓度过低阻碍引物与模板DNA的结合，不能产生有效扩增条带。浓度过高会引起非特异性扩增产物和引物二聚体等的形成^[6]，使目的DNA片段扩增量下降，条带不清晰。由图1可见，浓度为0.15 μmol/L时，扩增条带较弱，不清晰；0.20、0.30 μmol/L 条带比0.15 μmol/L清晰，但有弥散现象，不是很稳定，所以20 μL反应体积中确定条带稳定的 0.25 μmol/L 为最适引物浓度。

2.2 Mg2+浓度的优化

Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产物有显著的影响，Mg2+作为Taq DNA 聚合酶的依赖性因子，不仅影响Taq酶的活性，反应体系中的dNTPs、模板DNA及引物都会与Mg2+结合^[7]。Mg2+浓度过高反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。由图2可知， 4个Mg2+浓度， 即2.0、1.0、1.5、2.5 mmol/L条件下均有扩增产物，但是Mg2+浓度在1.0、1.5 mmol/L时，条带较少；浓度在2.5 mmol/L时出现非特异性扩增，浓度在 2.0 mmol/L 时条带清晰，稳定性高。所以Mg2+用量为 2.0 mmol/L 是最佳浓度。

2.3 Taq DNA聚合酶的优化

Taq DNA聚合酶的用量是影响扩增的重要因素，浓度过低会使酶过早地消耗完造成合成效率下降，浓度过高容易产生非特异性扩增且增加成本。从图3可见，不同Taq DNA聚合酶浓度从0.5、1.0、1.5、2.0 U/μL均有扩增产物，浓度在0.5 U/μL条带相对较弱，1.0、1.5、2.0 U/μL时扩增出的条带无显著差异，考虑稳定性和成本，而且1.5 U/μL的条带亮度高和稳定性强。最终确定Taq DNA聚合酶用量为1.0 U/μL。

2.4 dNTPs浓度的优化

dNTPs浓度与PCR扩增效率有密切关系，dNTPs能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。浓度高会导致片段缺失，而浓度太低又会导致扩增产率下降^[4]。从图4中可见，dNTPs浓度为0.15、0.20、 0.25、0.30 mmol/L均有扩增条带，dNTPs浓度为0.15、0.30 mmol/L时，扩增出的条带较少；在0.20、0.25 mmol/L时扩增条带较多，但0.25 mmol/L比0.20 mmol/L 条带清晰。因此确定dNTPs浓度为0.25 mmol/L。

2.5 退火温度的优化

为了确定引物的最适退火温度，参照所选引物序列计算理论退火温度Tm，Tm=4（G+C）+2（A+T）^[8]。温度低于Tm值，扩增产物特异性降低，扩增出来的条带较弱；温度过高不利于引物扩增。在本试验中所用引物的Tm值为53 ℃， 从

3 结论与讨论

试验结果表明，通过各个因素的综合对比分析，得出反应体系中4个因子的最佳浓度：0.25 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、50 ng/μL 模板DNA。PCR反应条件：94℃预变性4min；94 ℃ 变性 45 s，UBC 835退火温度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

ISSR-PCR具有高重复性的优点，但其扩增仍受多种因素的影响，如Mg2+用量、引物浓度、Taq[KG*3]DNA聚合酶用量、退火温度、模板DNA等。试验研究发现，模板DNA对ISSR-PCR扩增的影响不是很大，而Taq DNA聚合酶和Mg2+对其有很大的作用。Mg2+浓度控制Taq DNA聚合酶的活性，Taq DNA聚合酶的活性又是ISSR-PCR扩增的关键。而dNTP是PCR反应的原料，浓度过高时容易导致错配，同时dNTP会对Mg2+产生拮抗作用^[9]，退火温度高低制约扩增条带的分辨率。上述因素相互依赖、相互抑制。为获得重复性好、可靠性高的扩增条带^[10-11]，本试验采用单因素试验方法来确定各因素的最佳浓度。单因素试验设计可对每个影响因子不同水平进行直观的判断。确定了沙地云杉ISSR-PCR各因素的最适浓度，试验结果对沙地云杉进行遗传多样性分析等研究奠定了基础。

参考文献：

[1]李银科，刘世增，康才周，等. 温度对樟子松和沙地云杉种子萌发特征的影响[J]. 水土保持通报，2011，31（4）：73-77.

[2]刘瑞芬.沙地云杉引种实验[J]. 内蒙古林业调查设计，2008，31（6）：75-77，80.

[3]罗玥佶，伍贤进，彭 帅，等. 翻白草总DNA的提取与ISSR-PCR体系的建立与优化[J]. 安徽农业科学，2008，36（3）：895-897，901.

[4]桂腾琴，乔爱民，孙 敏，等. 果梅ISSR-PCR反应体系的建立和优化[J]. 西南大学学报：自然科学版，2007，29（10）：124-128.

[5]赵 谦，杜 虹，庄东红. ISSR分子标记及其在植物研究中的应用[J]. 分子植物育种，2007，6（增刊1）：123-129.

[6]刘 娜，王昌命，普晓兰. 云南松胚乳DNA提取与ISSR-PCR反应体系的建立[J]. 西南林学院学报，2009，29（2）：27-30.

[7]乔燕春，林顺权，杨向晖，等. 均匀设计在枇杷ISSR-PCR反应体系优化中的应用[J]. 基因组学与应用生物学，2009，28（1）：123-126.

[8]卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M]. 2版.北京：中国协和医科大学出版社，1999：57-58.

[9]王 亚，郭志强，王宏伟，等. 单雌蓖麻ISSR-PCR反应体系的建立和优化[J]. 山西农业科学，2010，38（1）：15-18.

[10]刘小溪，李枝林，贾文杰，等. 百合ISSR-PCR反应体系的优化[J]. 江苏农业科学，2012，40（1）：30-33.

[11]张 蕾，严 萍，韩正洲，等. 两面针ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]. 广州中医药大学学报，2012，29（1）：70-74.

2.3 Taq DNA聚合酶的优化

Taq DNA聚合酶的用量是影响扩增的重要因素，浓度过低会使酶过早地消耗完造成合成效率下降，浓度过高容易产生非特异性扩增且增加成本。从图3可见，不同Taq DNA聚合酶浓度从0.5、1.0、1.5、2.0 U/μL均有扩增产物，浓度在0.5 U/μL条带相对较弱，1.0、1.5、2.0 U/μL时扩增出的条带无显著差异，考虑稳定性和成本，而且1.5 U/μL的条带亮度高和稳定性强。最终确定Taq DNA聚合酶用量为1.0 U/μL。

2.4 dNTPs浓度的优化

dNTPs浓度与PCR扩增效率有密切关系，dNTPs能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。浓度高会导致片段缺失，而浓度太低又会导致扩增产率下降^[4]。从图4中可见，dNTPs浓度为0.15、0.20、 0.25、0.30 mmol/L均有扩增条带，dNTPs浓度为0.15、0.30 mmol/L时，扩增出的条带较少；在0.20、0.25 mmol/L时扩增条带较多，但0.25 mmol/L比0.20 mmol/L 条带清晰。因此确定dNTPs浓度为0.25 mmol/L。

2.5 退火温度的优化

为了确定引物的最适退火温度，参照所选引物序列计算理论退火温度Tm，Tm=4（G+C）+2（A+T）^[8]。温度低于Tm值，扩增产物特异性降低，扩增出来的条带较弱；温度过高不利于引物扩增。在本试验中所用引物的Tm值为53 ℃， 从

3 结论与讨论

试验结果表明，通过各个因素的综合对比分析，得出反应体系中4个因子的最佳浓度：0.25 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、50 ng/μL 模板DNA。PCR反应条件：94℃预变性4min；94 ℃ 变性 45 s，UBC 835退火温度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

ISSR-PCR具有高重复性的优点，但其扩增仍受多种因素的影响，如Mg2+用量、引物浓度、Taq[KG*3]DNA聚合酶用量、退火温度、模板DNA等。试验研究发现，模板DNA对ISSR-PCR扩增的影响不是很大，而Taq DNA聚合酶和Mg2+对其有很大的作用。Mg2+浓度控制Taq DNA聚合酶的活性，Taq DNA聚合酶的活性又是ISSR-PCR扩增的关键。而dNTP是PCR反应的原料，浓度过高时容易导致错配，同时dNTP会对Mg2+产生拮抗作用^[9]，退火温度高低制约扩增条带的分辨率。上述因素相互依赖、相互抑制。为获得重复性好、可靠性高的扩增条带^[10-11]，本试验采用单因素试验方法来确定各因素的最佳浓度。单因素试验设计可对每个影响因子不同水平进行直观的判断。确定了沙地云杉ISSR-PCR各因素的最适浓度，试验结果对沙地云杉进行遗传多样性分析等研究奠定了基础。

参考文献：

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[9]王 亚，郭志强，王宏伟，等. 单雌蓖麻ISSR-PCR反应体系的建立和优化[J]. 山西农业科学，2010，38（1）：15-18.

[10]刘小溪，李枝林，贾文杰，等. 百合ISSR-PCR反应体系的优化[J]. 江苏农业科学，2012，40（1）：30-33.

[11]张 蕾，严 萍，韩正洲，等. 两面针ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]. 广州中医药大学学报，2012，29（1）：70-74.

2.3 Taq DNA聚合酶的优化

Taq DNA聚合酶的用量是影响扩增的重要因素，浓度过低会使酶过早地消耗完造成合成效率下降，浓度过高容易产生非特异性扩增且增加成本。从图3可见，不同Taq DNA聚合酶浓度从0.5、1.0、1.5、2.0 U/μL均有扩增产物，浓度在0.5 U/μL条带相对较弱，1.0、1.5、2.0 U/μL时扩增出的条带无显著差异，考虑稳定性和成本，而且1.5 U/μL的条带亮度高和稳定性强。最终确定Taq DNA聚合酶用量为1.0 U/μL。

2.4 dNTPs浓度的优化

dNTPs浓度与PCR扩增效率有密切关系，dNTPs能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。浓度高会导致片段缺失，而浓度太低又会导致扩增产率下降^[4]。从图4中可见，dNTPs浓度为0.15、0.20、 0.25、0.30 mmol/L均有扩增条带，dNTPs浓度为0.15、0.30 mmol/L时，扩增出的条带较少；在0.20、0.25 mmol/L时扩增条带较多，但0.25 mmol/L比0.20 mmol/L 条带清晰。因此确定dNTPs浓度为0.25 mmol/L。

2.5 退火温度的优化

为了确定引物的最适退火温度，参照所选引物序列计算理论退火温度Tm，Tm=4（G+C）+2（A+T）^[8]。温度低于Tm值，扩增产物特异性降低，扩增出来的条带较弱；温度过高不利于引物扩增。在本试验中所用引物的Tm值为53 ℃， 从

3 结论与讨论

试验结果表明，通过各个因素的综合对比分析，得出反应体系中4个因子的最佳浓度：0.25 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、50 ng/μL 模板DNA。PCR反应条件：94℃预变性4min；94 ℃ 变性 45 s，UBC 835退火温度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

ISSR-PCR具有高重复性的优点，但其扩增仍受多种因素的影响，如Mg2+用量、引物浓度、Taq[KG*3]DNA聚合酶用量、退火温度、模板DNA等。试验研究发现，模板DNA对ISSR-PCR扩增的影响不是很大，而Taq DNA聚合酶和Mg2+对其有很大的作用。Mg2+浓度控制Taq DNA聚合酶的活性，Taq DNA聚合酶的活性又是ISSR-PCR扩增的关键。而dNTP是PCR反应的原料，浓度过高时容易导致错配，同时dNTP会对Mg2+产生拮抗作用^[9]，退火温度高低制约扩增条带的分辨率。上述因素相互依赖、相互抑制。为获得重复性好、可靠性高的扩增条带^[10-11]，本试验采用单因素试验方法来确定各因素的最佳浓度。单因素试验设计可对每个影响因子不同水平进行直观的判断。确定了沙地云杉ISSR-PCR各因素的最适浓度，试验结果对沙地云杉进行遗传多样性分析等研究奠定了基础。

参考文献：

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[5]赵 谦，杜 虹，庄东红. ISSR分子标记及其在植物研究中的应用[J]. 分子植物育种，2007，6（增刊1）：123-129.

[6]刘 娜，王昌命，普晓兰. 云南松胚乳DNA提取与ISSR-PCR反应体系的建立[J]. 西南林学院学报，2009，29（2）：27-30.

[7]乔燕春，林顺权，杨向晖，等. 均匀设计在枇杷ISSR-PCR反应体系优化中的应用[J]. 基因组学与应用生物学，2009，28（1）：123-126.

[8]卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M]. 2版.北京：中国协和医科大学出版社，1999：57-58.

[9]王 亚，郭志强，王宏伟，等. 单雌蓖麻ISSR-PCR反应体系的建立和优化[J]. 山西农业科学，2010，38（1）：15-18.

[10]刘小溪，李枝林，贾文杰，等. 百合ISSR-PCR反应体系的优化[J]. 江苏农业科学，2012，40（1）：30-33.

[11]张 蕾，严 萍，韩正洲，等. 两面针ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]. 广州中医药大学学报，2012，29（1）：70-74.