肉制品中驴源性成分PCR方法的建立及应用

郭凤柳+熊蕊+刘晓慧+赵同欣+王娜+颜红

摘要：建立了驴源性成分的快速分子检测方法，确立了1对驴源性成分的特异性引物HorseF/HorseR，扩增目的片段的长度是294 bp，经验证引物对驴源性成分的特异性良好，确立了PCR反应的最佳反应体系和最优反应条件。反应体系的检测灵敏度是13.7 pg/μL。扩增片段经AluⅠ酶切分析确认，所得181、113 bp片段与分析结果一致。利用该方法对市售样品进行检测，检测结果准确。

关键词：驴源性成分；检测；PCR反应；肉品贸易；造假检测

中图分类号：S851.34 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0035-04

随着人们生活水平的提高，对肉的要求也越来越高，而目前国内市场上在肉和肉制品的生产与销售中，一些不法商家或个人利用掺杂掺假、以次充好等手段欺骗消费者以牟取暴利的事件屡屡出现。我国食品工业飞速发展，食品掺假方式越来越多，范围越来越广，内容越来越复杂。一些不法商家或个人为了追求自身利益以低价、劣质肉冒充高价、优质肉^[1]，如用鸡肉冒充猪肉，用猪肉、鸭肉冒充牛肉、羊肉等造假行为最为常见。这不仅涉及经济、营养价值和食品安全等问题，更直接影响消费者健康。此外，在清真食品中掺杂猪肉等行为还涉及宗教信仰等问题。因此，对食品中原料肉进行掺假、掺杂检验十分必要，其重点就是快速、准确鉴定肉制品品种。

保定驴肉火烧是著名小吃，和“保定三宝”并驾齐驱。驴肉中富含人体必需的氨基酸和脂肪酸，是一种高蛋白、低脂肪的营养食物。此外，驴肉中矿物元素铁含量高于其他畜禽肉，其食用价值高、营养丰富、味道鲜美，值得大力开发研究和推广^[2]。也是由于上述原因，驴肉在人们日常生活中的需求量越来越大，价格越来越高，致使其掺假问题也越来越普遍，因此肉种类鉴定是食品分析的一个重要方面。PCR技术是食品中肉类成分鉴别的主流技术，研究对象集中在市场上常见的羊肉、牛肉、猪肉、鸡肉上，目前还没有关于驴源性成分PCR检测方法的报道。本研究合成了1对用于检测驴源性成分的特异性引物，通过对反应体系的摸索及反应条件的优化，验证了该方法的特异性与灵敏度，建立了鉴定驴源性成分的PCR技术，旨在为杜绝食品贸易中的欺骗行为提供检测方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

蛋白酶K、RNA酶、dNTPs、10×PCR缓冲液、MgCl2、Taq DNA聚合酶、2 000 bp ladder DNA marker、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒以及血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒等均购自北京天根生化科技有限公司；Sau3AⅠ、AluⅠ限制性内切酶购自宝生物工程有限公司。引物合成及序列测定均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；其他试剂均为国产分析纯。

试验仪器：进口ABI梯度PCR扩增仪、凝胶成像仪及电泳系统、sigma台式离心机。

1.2 PCR引物

合成1对特异性引物，用高压灭菌后的超纯水溶解，配制成100 mol/L的储备液。引物序列：上游引物序列为5′-TGCCACAGTTGGATACATCAAC-3′；下游引物序列为5′-ATTGAGATTAGGCGATTGTT-3′；扩增目的条带长294 bp。

1.3 样本总DNA的提取

驴肉基因组DNA提取根据血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行。取适量基因组DNA在紫外分光光度计下检测其浓度和纯度。当D260 nm/D280 nm为1.7～1.9时，DNA纯度才适宜进行PCR扩增。

1.4 目的条带扩增

PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液（Mg2+ free）5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L 4×dNTPs 4 μL，引物HorseF和HorseR（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板10 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，补足无菌超纯水到25 μL。

PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性60 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。结束后4 ℃保存。

PCR结束后用2%琼脂糖凝胶，TAE电泳缓冲系统，9 V/cm 恒压电泳，2 000 bp ladder作为分子量对照对目的条带进行检测。

1.5 目的条带Sau3AⅠ、AluⅠ的酶切鉴定及测序

由于目的条带可能是马源性成分，因此对扩增产物要用马源性成分的限制性内切酶Sau3AⅠ进行酶切，片段大小分别是226、68 bp。驴源性成分的PCR扩增产物经限制性内切酶AluⅠ进行酶切，片段大小分别是113、181 bp。

用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带，将其进行酶切反应，体系为：Sau3AⅠ/AluⅠ1 μL，10×H Buffer 5 μL，PCR回收产物20 μL，用无菌ddH2O补足到50 μL。将反应体系配制好后放入37 ℃温浴1 h后65 ℃温浴5 min终止反应，酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

将回收的目的条带交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定，序列校对后，在GenBank中进行Blastn比对分析，验证所得片段。

1.6 检测体系的灵敏度、特异性检测

1.6.1 灵敏性检测

将熟驴肉的DNA模板依次进行10倍梯度稀释，直到10-6，每个稀释度各取2 μL作为模板，进行PCR扩增，同时设立阴性对照、阳性对照，电泳检测。

1.6.2 特异性检测

取已制备的牛、羊、狗、兔、羊、鸭等15种动物肉的DNA各0.1 μg作为模板，加入体系中进行扩增，同时设立阳性对照及空白对照，电泳检测。

1.7 市售肉制品检测

购置市售驴肉火烧、驴肉大饼和真空袋包装的驴肉样品，提取其DNA，用已建立的检测方法进行PCR扩增鉴定。

2 结果与分析

2.1 基因组提取和引物扩增结果

对熟驴肉提取的基因组DNA的D260 nm/D280 nm值均为 1.7～1.9，说明质量较好，可以用于下游试验操作。引物对驴肉的基因组DNA扩增出了目的条带（图1），目的条带回收后的酶切效果也较好（图2），得到了181、113 bp的条带。扩增的目的片段测序结果经校对后，在NCBI中经 Blastn分析，结果表明该片段的核苷酸序列与GenBank中已登记的Equus asinus（家驴）的相似性是100%，与Equus hemionus（野驴）等基因序列的相似性大于95 %，证明所得片段为目的片段。

2.2 PCR反应的灵敏度

驴肉提取的DNA浓度是68.5 ng/μL，将提取的DNA进行10～106倍梯度稀释后，如图4所示，在模板稀释104倍后再未出现反应条带，因此反应体系的灵敏度是 13.7 pg/μL。

2.3 PCR反应的特异性

引物对驴肉的基因组DNA扩增出了目的条带。如图5所示，引物对其他动物的DNA没有扩增出条带，但是对羊、狗的基因组也扩增出了相似条带。如图6所示，进一步进行酶切验证，结果没有得到正确的酶切结果，表明引物的特异性较高。

3 结论与讨论

肉类检测方法有多种多样，其中ELISA技术应用较多，ELISA技术是将抗原、抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合发展建立的一种免疫分析方法^[3]，但是该方法有一定的局限性：首先要有足够的抗体供检测分析；其次肉类食品在加工过程中经过加热、高压、辐射等处理，蛋白遭到破坏，不适合用ELISA方法检测。DNA分子分布广泛、结构稳定，作为遗传信息的载体，分子结构中携带了丰富的种源特异性信息^[4]，DNA检测是目前物种鉴定的最有效手段^[5-8]。DNA鉴定主要是通过PCR反应来实现。目前还没有驴肉检测方法，一般是凭色泽、纹理等简单方法进行辨认，因此需要找到具有说服力的检测方法。本研究使用的PCR方法灵敏度高、特异性强、速度快。

肉类产品放置1、2、9、16 d后，DNA片段会由3万bp降解到1.6万bp。加热到80 ℃，DNA片段长度不受影响，而达到100 ℃则DNA长度锐减至1 100 bp，加热至120 ℃减至600 bp以下。市售驴肉多经过高压处理，因此本研究中选择294 bp的短片段，这样即使经过高压处理，肉中模板DNA也不被破坏而出现假阴性结果。

引物是根据驴肉线粒体DNA设计合成的，因此具有高度的特异性，本研究表明，引物对其他动物的基因组DNA没有扩增到可以酶切到目的片段的PCR产物，因此该检测技术具有高度的特异性。

参考文献：

[1]刘帅帅，李 宏，罗世芝，等. PCR技术在肉类掺假检验中的应用进展[J]. 食品安全质量检测学报，2011，2（6）：280-284.

[2]尤 娟，罗永康，张岩春，等. 驴肉主要营养成分及与其它畜禽肉的分析比较[J]. 肉类研究，2008（7）：20-22.

[3]张占军，王富花. 酶联免疫吸附技术及其在食品安全检测中的应用[J]. 食品研究与开发，2011，32（1）：157-160.

[4]Fajardo V，Gonzalez I，Rojas M，et al. A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species[J]. Trends in Food Science & Technology，2010，21（8）：408-421.

[5]王 薇，王利丽，熊莉丽，等. ITS序列作为DNA条形码在虫草鉴定及系统发育关系中的研究与应用[J]. 江苏农业学报，2012，28（3）：680-682.

[6]Aida A A，Man Y B，Wong C M，et al. Analysis of raw meats and fats of pigs using polymerase chain reaction for halal authentication[J]. Meat Science，2005，69（1）：47-52.

[7]田慧敏，刘铁志. DNA分子标记技术在红菇分子鉴定中的应用进展[J]. 江苏农业科学，2013，41（4）：28-31.

[8]Lockley A K，Bardsley R G. DNA-based methods for food authentication[J]. Trends in Food Science & Technology，2000，11（2）：67-77.

1.7 市售肉制品检测

购置市售驴肉火烧、驴肉大饼和真空袋包装的驴肉样品，提取其DNA，用已建立的检测方法进行PCR扩增鉴定。

2 结果与分析

2.1 基因组提取和引物扩增结果

对熟驴肉提取的基因组DNA的D260 nm/D280 nm值均为 1.7～1.9，说明质量较好，可以用于下游试验操作。引物对驴肉的基因组DNA扩增出了目的条带（图1），目的条带回收后的酶切效果也较好（图2），得到了181、113 bp的条带。扩增的目的片段测序结果经校对后，在NCBI中经 Blastn分析，结果表明该片段的核苷酸序列与GenBank中已登记的Equus asinus（家驴）的相似性是100%，与Equus hemionus（野驴）等基因序列的相似性大于95 %，证明所得片段为目的片段。

2.2 PCR反应的灵敏度

驴肉提取的DNA浓度是68.5 ng/μL，将提取的DNA进行10～106倍梯度稀释后，如图4所示，在模板稀释104倍后再未出现反应条带，因此反应体系的灵敏度是 13.7 pg/μL。

2.3 PCR反应的特异性

引物对驴肉的基因组DNA扩增出了目的条带。如图5所示，引物对其他动物的DNA没有扩增出条带，但是对羊、狗的基因组也扩增出了相似条带。如图6所示，进一步进行酶切验证，结果没有得到正确的酶切结果，表明引物的特异性较高。

3 结论与讨论

肉类检测方法有多种多样，其中ELISA技术应用较多，ELISA技术是将抗原、抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合发展建立的一种免疫分析方法^[3]，但是该方法有一定的局限性：首先要有足够的抗体供检测分析；其次肉类食品在加工过程中经过加热、高压、辐射等处理，蛋白遭到破坏，不适合用ELISA方法检测。DNA分子分布广泛、结构稳定，作为遗传信息的载体，分子结构中携带了丰富的种源特异性信息^[4]，DNA检测是目前物种鉴定的最有效手段^[5-8]。DNA鉴定主要是通过PCR反应来实现。目前还没有驴肉检测方法，一般是凭色泽、纹理等简单方法进行辨认，因此需要找到具有说服力的检测方法。本研究使用的PCR方法灵敏度高、特异性强、速度快。

肉类产品放置1、2、9、16 d后，DNA片段会由3万bp降解到1.6万bp。加热到80 ℃，DNA片段长度不受影响，而达到100 ℃则DNA长度锐减至1 100 bp，加热至120 ℃减至600 bp以下。市售驴肉多经过高压处理，因此本研究中选择294 bp的短片段，这样即使经过高压处理，肉中模板DNA也不被破坏而出现假阴性结果。

引物是根据驴肉线粒体DNA设计合成的，因此具有高度的特异性，本研究表明，引物对其他动物的基因组DNA没有扩增到可以酶切到目的片段的PCR产物，因此该检测技术具有高度的特异性。

参考文献：

[1]刘帅帅，李 宏，罗世芝，等. PCR技术在肉类掺假检验中的应用进展[J]. 食品安全质量检测学报，2011，2（6）：280-284.

[2]尤 娟，罗永康，张岩春，等. 驴肉主要营养成分及与其它畜禽肉的分析比较[J]. 肉类研究，2008（7）：20-22.

[3]张占军，王富花. 酶联免疫吸附技术及其在食品安全检测中的应用[J]. 食品研究与开发，2011，32（1）：157-160.

[4]Fajardo V，Gonzalez I，Rojas M，et al. A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species[J]. Trends in Food Science & Technology，2010，21（8）：408-421.

[5]王 薇，王利丽，熊莉丽，等. ITS序列作为DNA条形码在虫草鉴定及系统发育关系中的研究与应用[J]. 江苏农业学报，2012，28（3）：680-682.

[6]Aida A A，Man Y B，Wong C M，et al. Analysis of raw meats and fats of pigs using polymerase chain reaction for halal authentication[J]. Meat Science，2005，69（1）：47-52.

[7]田慧敏，刘铁志. DNA分子标记技术在红菇分子鉴定中的应用进展[J]. 江苏农业科学，2013，41（4）：28-31.

[8]Lockley A K，Bardsley R G. DNA-based methods for food authentication[J]. Trends in Food Science & Technology，2000，11（2）：67-77.

1.7 市售肉制品检测

购置市售驴肉火烧、驴肉大饼和真空袋包装的驴肉样品，提取其DNA，用已建立的检测方法进行PCR扩增鉴定。

2 结果与分析

2.1 基因组提取和引物扩增结果

对熟驴肉提取的基因组DNA的D260 nm/D280 nm值均为 1.7～1.9，说明质量较好，可以用于下游试验操作。引物对驴肉的基因组DNA扩增出了目的条带（图1），目的条带回收后的酶切效果也较好（图2），得到了181、113 bp的条带。扩增的目的片段测序结果经校对后，在NCBI中经 Blastn分析，结果表明该片段的核苷酸序列与GenBank中已登记的Equus asinus（家驴）的相似性是100%，与Equus hemionus（野驴）等基因序列的相似性大于95 %，证明所得片段为目的片段。

2.2 PCR反应的灵敏度

驴肉提取的DNA浓度是68.5 ng/μL，将提取的DNA进行10～106倍梯度稀释后，如图4所示，在模板稀释104倍后再未出现反应条带，因此反应体系的灵敏度是 13.7 pg/μL。

2.3 PCR反应的特异性

引物对驴肉的基因组DNA扩增出了目的条带。如图5所示，引物对其他动物的DNA没有扩增出条带，但是对羊、狗的基因组也扩增出了相似条带。如图6所示，进一步进行酶切验证，结果没有得到正确的酶切结果，表明引物的特异性较高。

3 结论与讨论

肉类检测方法有多种多样，其中ELISA技术应用较多，ELISA技术是将抗原、抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合发展建立的一种免疫分析方法^[3]，但是该方法有一定的局限性：首先要有足够的抗体供检测分析；其次肉类食品在加工过程中经过加热、高压、辐射等处理，蛋白遭到破坏，不适合用ELISA方法检测。DNA分子分布广泛、结构稳定，作为遗传信息的载体，分子结构中携带了丰富的种源特异性信息^[4]，DNA检测是目前物种鉴定的最有效手段^[5-8]。DNA鉴定主要是通过PCR反应来实现。目前还没有驴肉检测方法，一般是凭色泽、纹理等简单方法进行辨认，因此需要找到具有说服力的检测方法。本研究使用的PCR方法灵敏度高、特异性强、速度快。

肉类产品放置1、2、9、16 d后，DNA片段会由3万bp降解到1.6万bp。加热到80 ℃，DNA片段长度不受影响，而达到100 ℃则DNA长度锐减至1 100 bp，加热至120 ℃减至600 bp以下。市售驴肉多经过高压处理，因此本研究中选择294 bp的短片段，这样即使经过高压处理，肉中模板DNA也不被破坏而出现假阴性结果。

引物是根据驴肉线粒体DNA设计合成的，因此具有高度的特异性，本研究表明，引物对其他动物的基因组DNA没有扩增到可以酶切到目的片段的PCR产物，因此该检测技术具有高度的特异性。

参考文献：

[1]刘帅帅，李 宏，罗世芝，等. PCR技术在肉类掺假检验中的应用进展[J]. 食品安全质量检测学报，2011，2（6）：280-284.

[2]尤 娟，罗永康，张岩春，等. 驴肉主要营养成分及与其它畜禽肉的分析比较[J]. 肉类研究，2008（7）：20-22.

[3]张占军，王富花. 酶联免疫吸附技术及其在食品安全检测中的应用[J]. 食品研究与开发，2011，32（1）：157-160.

[4]Fajardo V，Gonzalez I，Rojas M，et al. A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species[J]. Trends in Food Science & Technology，2010，21（8）：408-421.

[5]王 薇，王利丽，熊莉丽，等. ITS序列作为DNA条形码在虫草鉴定及系统发育关系中的研究与应用[J]. 江苏农业学报，2012，28（3）：680-682.

[6]Aida A A，Man Y B，Wong C M，et al. Analysis of raw meats and fats of pigs using polymerase chain reaction for halal authentication[J]. Meat Science，2005，69（1）：47-52.

[7]田慧敏，刘铁志. DNA分子标记技术在红菇分子鉴定中的应用进展[J]. 江苏农业科学，2013，41（4）：28-31.

[8]Lockley A K，Bardsley R G. DNA-based methods for food authentication[J]. Trends in Food Science & Technology，2000，11（2）：67-77.