致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌外膜蛋白A前体蛋白的克隆表达

张笛+张勇攀+钱文正+于恩琪+秦爱建+金文杰

摘要：以致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌分离株G8107菌株基因组DNA为模板，用PCR法扩增ompA precursor基因，PCR产物用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，酶切产物回收与相同黏性末端的表达载体 pET-32a（+）连接构建表达ompA precursor的重组质粒，将此重组质粒转化入表达宿主菌BL21（DE3），抽提质粒，酶切鉴定及测序正确后诱导表达。对转化菌株以 IPTG 进行诱导后，裂解细菌，离心，上清进行 SDS-PAGE鉴定。测序结果显示，ompA precursor基因大小为 1 014 bp，编码 338 个氨基酸残基，蛋白相对分子质量约为36。原核表达产物经 SDS-PAGE 分析表明，以28 ℃ 1.0 mmol/L 的 IPTG 诱导6 h，该基因表达效果最好。经Western Blot检测，表达的重组蛋白可与抗His标签蛋白单抗反应。

关键词：致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌；外膜蛋白前体；克隆与表达

中图分类号：S858.33 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0032-03

鹅卵黄性腹膜炎是一种主要发生于产蛋种鹅的疾病^[1]。该病的发生主要是由于公鹅生殖器感染大肠杆菌，在交配的过程中传染给母鹅，导致输卵管感染大肠杆菌出现炎症，最终导致卵黄性腹膜炎。该病会导致产蛋母鹅生产性能下降甚至绝产，严重的导致产蛋母鹅死亡，造成巨大的经济损失^[2-4]。大肠杆菌是自然界广泛存在的条件性致病菌，其被发现后很长一段时间内一直被当做肠道内的正常菌群而非致病菌，后来人类才认识到某些血清型的大肠杆菌对人、畜禽具有致病性，当动物机体抵抗力下降或免疫功能受损时可引发感染。外膜蛋白A是广泛存在于革兰氏阴性肠杆菌外膜上的蛋白，OmpA precursor是大肠杆菌外膜蛋白A的前体蛋白。徐淑华以OmpA为指示蛋白，研究E.coli的Prlc基因产物对OmpA前体蛋白翻译后转位功能，结果表明，Prlc基因产物在一定程度上能增进OmpA的转位定域^[5]。OmpA是细菌抗宿主杀伤因子，能维持细菌外膜结构完整及细菌形态正常，同时在细菌黏附、侵袭起始过程中起关键作用。OmpA具有良好的免疫原性，是先天免疫系统的重要靶位，也可以在免疫逃逸中发挥重要作用^[6-8]。由于OmpA 蛋白的生物学特性，而且在革兰氏阴性杆菌中OmpA蛋白普遍存在，因此也可以将其作为疫苗的候选分子^[9-10]。本研究选取差异蛋白OmpA前体蛋白，对蛋白进行体外克隆表达，进而探索蛋白在细菌中与宿主的关系，旨在为揭示蛋白功能及鹅卵黄性腹膜炎发生机理提供帮助。

1 材料与方法

1.1 菌种与载体

致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌菌株G8107由扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室分离保存。原核表达载体 pET-32a（+）、大肠杆菌BL21（DE3）均由该实验室保存。

1.2 试剂

Tryptone、Yeast Extract为Oxiod公司产品；Taq酶、dNTP、10×buffer、1 kb marker、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ购自Fermantes生物工程公司；质粒提取试剂盒、PCR产物及凝胶纯化回收试剂盒购自Axygen公司；PCR引物由华大基因合成；甲叉双丙烯酰胺、TEMED、NBT、咪唑为Amresco公司产品；蛋白质纯化镍柱购自GE公司；蛋白marker 购自Fermantes公司；His 标签抗体为笔者所在实验室自制；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计及合成

根据GenBank上发表的大肠杆菌Escherichia coli O157：H7 str. EC1212 的ompA precursor基因序列设计PCR扩增引物，在上游引物5′末端加入EcoRⅠ 限制性酶切位点及保护性碱基，下游引物5′末端加入XhoⅠ限制性酶切位点及保护性碱基。引物序列为：上游引物：5′-CTGAATTCCTGGCACTGGCTGGTTTC-3′；下游引物：5′- ATCTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGT-3′。PCR 扩增产物大小为1 014 bp。

1.4 PCR 扩增目的基因

以致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌菌株G8107基因组 DNA 为模板扩增ompA precursor基因片段，取新鲜培养的细菌菌液，12 000 r/min离心1 min，去上清，沉淀用100 μL超纯水重悬，将重悬的沉淀煮沸10 min，-20 ℃冻存10 min，取出融化，12 000 r/min 离心5 min，将上清转移至另一离心管中用于PCR。反应条件为 95 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，63 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 20 s，循环35次；72 ℃延伸10 min。用PCR产物纯化试剂盒说明书操作回收目的基因。

1.5 目的基因 ompA precursor的克隆及测序

回收的 PCR 产物、pET-32a（+）空载体质粒用EcoRⅠ、 XhoⅠ双酶切，再次回收产物，将ompA precursor 2次胶回收产物及双酶切后的表达载体pET-32a（+）在连接酶的作用下于16 ℃过夜连接。取连接产物10 μL转入E.coli BL21（DE3）感受态细胞内（CaCl2法），涂布于含0.1%氨苄的LB 琼脂平板上，37 ℃培养过夜。挑取单菌落于液体培养基中培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，经双酶切鉴定正确的为阳性，将阳性细菌送测序，测序结果正确的细菌用于表达。

1.6 OmpA precursor融合蛋白表达条件摸索及蛋白纯化

经鉴定正确新鲜的ompA precursor阳性重组菌及含有pET-32a（+）质粒的BL21（DE3）空载体菌按1 ∶100转接种培养3 h，加入 IPTG，终浓度分别为0、0.25、0.5、0.75、1、1.25 mmol/L，28 ℃分别诱导 2、3、4、5、6 h，每隔1 h收获相应细菌。等体积菌液4 ℃ 8 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用1 mL无菌PBS溶液洗涤，4 ℃ 8 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用400 μL无菌超轻水重悬，悬液超声裂解，裂解液4 ℃ 8 000 r/min离心10 min，取上清测定浓度，通过 SDS-PAGE 确定蛋白最佳表达条件。确定最佳表达条件后采用相同方法大量表达蛋白，裂解上清经0.22 μm滤膜过滤后用His标签镍柱对上清进行纯化。

1.7 Western Blot验证

将经诱导表达、纯化的上清加 6×上样buffer混匀，沸水浴10 min，冰浴5 min，离心后取上清进行SDS-PAGE。按分子克隆方法，采用电转移方法将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上，5%脱脂乳4 ℃过夜封闭，一抗为笔者所在实验室自制的抗His 标签蛋白单抗腹水（稀释度为1 ∶2 000），37 ℃作用1 h，二抗采用AP标记的羊抗鼠 IgG（稀释度为 1 ∶30 000），37 ℃作用1 h，NBT显色。

2 结果与分析

2.1 ompA基因的 PCR 扩增和表达质粒的构建

以致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌G8107基因组为模板进行 PCR 扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳，以1 kb marker为参照，在1 000 bp左右位置得到与预期大小一致的扩增条带，结果如图1所示。

将回收的ompA precursor PCR产物、pET-32a（+）空载体质粒用EcoRⅠ、 XhoⅠ双酶切，再次回收产物，进行1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到5 900、1 014 bp 2个目的条带，结果如图2所示。

将双酶切后回收的ompA precursor片段及pET-32a（+）载体连接，构建pET32a-pre-ompA重组质粒。该重组质粒双酶切后，可得到与目的基因（1 014 bp）及载体（5 900 bp）大小相同的2个片段，如图3所示。将重组细菌送测序鉴定，结果正确。

2.3 pET32a-pre-ompA重组表达蛋白Western Blot鉴定

将纯化后的蛋白上清进行SDS-PAGE蛋白电泳，随后转印至硝酸纤维素膜上进行Western Blot分析，在分子量 54 ku 处可见阳性条带（图10）。

3 结论与讨论

鹅卵黄性腹膜炎别称鹅蛋子瘟，是一种主要发生于产蛋种鹅的疾病，能导致鹅生产性能下降甚至死亡。目前，有关鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌的致病机理仍不清楚。1977 年，Chai等发现，大肠杆菌的 OmpA 蛋白是大肠杆菌外膜上的主要蛋白^[10]。1984 年 Morona等预测 OmpA 蛋白为多次跨膜结构^[11]。1998 年 Pautsch等描述了第1个 OmpA 蛋白的晶体结构^[12]。本研究的OmpA precursor为二维电泳差异蛋白。研究表明，大肠杆菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性并且能够诱导机体脾淋巴细胞增殖，增强了淋巴细胞活化，在免疫反应中具有重要作用^[13]。OmpA 普遍存在于大肠杆菌菌体外膜中，是大肠杆菌重要的毒力因子，参与大肠杆菌对宿主细胞的黏附作用与侵袭功能^[14]。本研究成功克隆了致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌的外膜蛋白A前体蛋白基因，并在原核表达载体pET-32a（+）中成功表达，同时确定了最佳表达时间、温度及诱导剂IPTG的浓度。Western Blot结果表明，融合蛋白能够与抗His标签蛋白单抗腹水反应。由于本研究期望获得可溶性表达并尽量保持蛋白原空间构象的完整，因此只选择细菌裂解上清进行镍柱纯化，对于包涵体中的蛋白并未用常用的中性去垢剂例如吐温、NP40进行处理，结果发现，纯化的蛋白在透析及浓缩的过程中极易发生析出，同时冻融后极易发生降解。免疫印迹试验存在杂条带，初步分析这可能是OmpA前体蛋白发生降解的原因，应作进一步研究。

参考文献：

[1]王永坤，田慧芳. 鹅蛋子瘟防治的研究[J]. 中国禽业导刊，2003，20（11）：19-20.

[2]吴立芬. 母鹅卵黄性腹膜炎的发生及防治[J]. 现代农业科技，2009（13）：339.

[3]施馥寿. 控制卵黄性腹膜炎的尝试[J]. 家禽，1985（2）：11.

[4]王尚荣. 鹅卵黄性腹膜炎的诊疗报告[J]. 中国动物检疫，2005，22（4）：39-40.

[5]徐淑华. E.coli的Prlc基因产物对OmpA前体蛋白翻译后转位的功能[J]. 生物化学杂志，1991，6（7）：651-656.

[6]Belaaouaj A，Kim K S，Shapiro S D. Degradation of outer membrane protein A in Escherichia coli killing by neutrophil elastase[J]. Science，2000，289（5482）：1185-1188.

[7]Prasadarao N V，Blom A M，Villoutreix B O，et al. A novel interaction of outer membrane protein A with C4b binding protein mediates serum resistance of Escherichia coli K1[J]. Journal of Immunology，2002，169（11）：6352-6360.

[8]Sukumaran S K，Shimada H，Prasadarao N V. Entry and intracellular replication of Escherichia coli K1 in macrophages require expression of outer membrane protein A[J]. Infection and Immunity，2003，71（10）：5951-5961.

[9]呼 锐，佟春玉，崔玉东.大肠杆菌外膜蛋白A在原核表达载体中的克隆表达[J]. 黑龙江八一农垦大学学报，2011，23（1）：56-59.

[10]Chai T J，Foulds J.Purification of protein A，an outer membrane component missing in Escherichia coli K-12 ompA mutants[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1977，493（1）：210-215.

[11]Morona R，Klose M，Henning U. Escherichia coli K-12 outer membrane protein（OmpA） as a bacteriophage receptor：analysis of mutant genes expressing altered proteins[J]. Journal of Bacteriology，1984，159（2）：570-578.

[12]Pautsch A，Schulz G E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain[J]. Nature Structural Biology，1998，5（11）：1013-1017.

[13]李晓霞，邱玉玉，王海荣. 肠致病性大肠杆菌外膜蛋白免疫保护性研究[J]. 中国免疫学杂志，2007，23（5）：394-397.

[14]宋 舟，陈 伟，张立艳，等. 大肠杆菌外膜蛋白A研究进展[J]. 中国畜牧兽医，2012，39（5）：199-202.

1.7 Western Blot验证

将经诱导表达、纯化的上清加 6×上样buffer混匀，沸水浴10 min，冰浴5 min，离心后取上清进行SDS-PAGE。按分子克隆方法，采用电转移方法将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上，5%脱脂乳4 ℃过夜封闭，一抗为笔者所在实验室自制的抗His 标签蛋白单抗腹水（稀释度为1 ∶2 000），37 ℃作用1 h，二抗采用AP标记的羊抗鼠 IgG（稀释度为 1 ∶30 000），37 ℃作用1 h，NBT显色。

2 结果与分析

2.1 ompA基因的 PCR 扩增和表达质粒的构建

以致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌G8107基因组为模板进行 PCR 扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳，以1 kb marker为参照，在1 000 bp左右位置得到与预期大小一致的扩增条带，结果如图1所示。

将回收的ompA precursor PCR产物、pET-32a（+）空载体质粒用EcoRⅠ、 XhoⅠ双酶切，再次回收产物，进行1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到5 900、1 014 bp 2个目的条带，结果如图2所示。

将双酶切后回收的ompA precursor片段及pET-32a（+）载体连接，构建pET32a-pre-ompA重组质粒。该重组质粒双酶切后，可得到与目的基因（1 014 bp）及载体（5 900 bp）大小相同的2个片段，如图3所示。将重组细菌送测序鉴定，结果正确。

2.3 pET32a-pre-ompA重组表达蛋白Western Blot鉴定

将纯化后的蛋白上清进行SDS-PAGE蛋白电泳，随后转印至硝酸纤维素膜上进行Western Blot分析，在分子量 54 ku 处可见阳性条带（图10）。

3 结论与讨论

鹅卵黄性腹膜炎别称鹅蛋子瘟，是一种主要发生于产蛋种鹅的疾病，能导致鹅生产性能下降甚至死亡。目前，有关鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌的致病机理仍不清楚。1977 年，Chai等发现，大肠杆菌的 OmpA 蛋白是大肠杆菌外膜上的主要蛋白^[10]。1984 年 Morona等预测 OmpA 蛋白为多次跨膜结构^[11]。1998 年 Pautsch等描述了第1个 OmpA 蛋白的晶体结构^[12]。本研究的OmpA precursor为二维电泳差异蛋白。研究表明，大肠杆菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性并且能够诱导机体脾淋巴细胞增殖，增强了淋巴细胞活化，在免疫反应中具有重要作用^[13]。OmpA 普遍存在于大肠杆菌菌体外膜中，是大肠杆菌重要的毒力因子，参与大肠杆菌对宿主细胞的黏附作用与侵袭功能^[14]。本研究成功克隆了致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌的外膜蛋白A前体蛋白基因，并在原核表达载体pET-32a（+）中成功表达，同时确定了最佳表达时间、温度及诱导剂IPTG的浓度。Western Blot结果表明，融合蛋白能够与抗His标签蛋白单抗腹水反应。由于本研究期望获得可溶性表达并尽量保持蛋白原空间构象的完整，因此只选择细菌裂解上清进行镍柱纯化，对于包涵体中的蛋白并未用常用的中性去垢剂例如吐温、NP40进行处理，结果发现，纯化的蛋白在透析及浓缩的过程中极易发生析出，同时冻融后极易发生降解。免疫印迹试验存在杂条带，初步分析这可能是OmpA前体蛋白发生降解的原因，应作进一步研究。

参考文献：

[1]王永坤，田慧芳. 鹅蛋子瘟防治的研究[J]. 中国禽业导刊，2003，20（11）：19-20.

[2]吴立芬. 母鹅卵黄性腹膜炎的发生及防治[J]. 现代农业科技，2009（13）：339.

[3]施馥寿. 控制卵黄性腹膜炎的尝试[J]. 家禽，1985（2）：11.

[4]王尚荣. 鹅卵黄性腹膜炎的诊疗报告[J]. 中国动物检疫，2005，22（4）：39-40.

[5]徐淑华. E.coli的Prlc基因产物对OmpA前体蛋白翻译后转位的功能[J]. 生物化学杂志，1991，6（7）：651-656.

[6]Belaaouaj A，Kim K S，Shapiro S D. Degradation of outer membrane protein A in Escherichia coli killing by neutrophil elastase[J]. Science，2000，289（5482）：1185-1188.

[7]Prasadarao N V，Blom A M，Villoutreix B O，et al. A novel interaction of outer membrane protein A with C4b binding protein mediates serum resistance of Escherichia coli K1[J]. Journal of Immunology，2002，169（11）：6352-6360.

[8]Sukumaran S K，Shimada H，Prasadarao N V. Entry and intracellular replication of Escherichia coli K1 in macrophages require expression of outer membrane protein A[J]. Infection and Immunity，2003，71（10）：5951-5961.

[9]呼 锐，佟春玉，崔玉东.大肠杆菌外膜蛋白A在原核表达载体中的克隆表达[J]. 黑龙江八一农垦大学学报，2011，23（1）：56-59.

[10]Chai T J，Foulds J.Purification of protein A，an outer membrane component missing in Escherichia coli K-12 ompA mutants[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1977，493（1）：210-215.

[11]Morona R，Klose M，Henning U. Escherichia coli K-12 outer membrane protein（OmpA） as a bacteriophage receptor：analysis of mutant genes expressing altered proteins[J]. Journal of Bacteriology，1984，159（2）：570-578.

[12]Pautsch A，Schulz G E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain[J]. Nature Structural Biology，1998，5（11）：1013-1017.

[13]李晓霞，邱玉玉，王海荣. 肠致病性大肠杆菌外膜蛋白免疫保护性研究[J]. 中国免疫学杂志，2007，23（5）：394-397.

[14]宋 舟，陈 伟，张立艳，等. 大肠杆菌外膜蛋白A研究进展[J]. 中国畜牧兽医，2012，39（5）：199-202.

1.7 Western Blot验证

将经诱导表达、纯化的上清加 6×上样buffer混匀，沸水浴10 min，冰浴5 min，离心后取上清进行SDS-PAGE。按分子克隆方法，采用电转移方法将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上，5%脱脂乳4 ℃过夜封闭，一抗为笔者所在实验室自制的抗His 标签蛋白单抗腹水（稀释度为1 ∶2 000），37 ℃作用1 h，二抗采用AP标记的羊抗鼠 IgG（稀释度为 1 ∶30 000），37 ℃作用1 h，NBT显色。

2 结果与分析

2.1 ompA基因的 PCR 扩增和表达质粒的构建

以致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌G8107基因组为模板进行 PCR 扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳，以1 kb marker为参照，在1 000 bp左右位置得到与预期大小一致的扩增条带，结果如图1所示。

将回收的ompA precursor PCR产物、pET-32a（+）空载体质粒用EcoRⅠ、 XhoⅠ双酶切，再次回收产物，进行1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到5 900、1 014 bp 2个目的条带，结果如图2所示。

将双酶切后回收的ompA precursor片段及pET-32a（+）载体连接，构建pET32a-pre-ompA重组质粒。该重组质粒双酶切后，可得到与目的基因（1 014 bp）及载体（5 900 bp）大小相同的2个片段，如图3所示。将重组细菌送测序鉴定，结果正确。

2.3 pET32a-pre-ompA重组表达蛋白Western Blot鉴定

将纯化后的蛋白上清进行SDS-PAGE蛋白电泳，随后转印至硝酸纤维素膜上进行Western Blot分析，在分子量 54 ku 处可见阳性条带（图10）。

3 结论与讨论

鹅卵黄性腹膜炎别称鹅蛋子瘟，是一种主要发生于产蛋种鹅的疾病，能导致鹅生产性能下降甚至死亡。目前，有关鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌的致病机理仍不清楚。1977 年，Chai等发现，大肠杆菌的 OmpA 蛋白是大肠杆菌外膜上的主要蛋白^[10]。1984 年 Morona等预测 OmpA 蛋白为多次跨膜结构^[11]。1998 年 Pautsch等描述了第1个 OmpA 蛋白的晶体结构^[12]。本研究的OmpA precursor为二维电泳差异蛋白。研究表明，大肠杆菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性并且能够诱导机体脾淋巴细胞增殖，增强了淋巴细胞活化，在免疫反应中具有重要作用^[13]。OmpA 普遍存在于大肠杆菌菌体外膜中，是大肠杆菌重要的毒力因子，参与大肠杆菌对宿主细胞的黏附作用与侵袭功能^[14]。本研究成功克隆了致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌的外膜蛋白A前体蛋白基因，并在原核表达载体pET-32a（+）中成功表达，同时确定了最佳表达时间、温度及诱导剂IPTG的浓度。Western Blot结果表明，融合蛋白能够与抗His标签蛋白单抗腹水反应。由于本研究期望获得可溶性表达并尽量保持蛋白原空间构象的完整，因此只选择细菌裂解上清进行镍柱纯化，对于包涵体中的蛋白并未用常用的中性去垢剂例如吐温、NP40进行处理，结果发现，纯化的蛋白在透析及浓缩的过程中极易发生析出，同时冻融后极易发生降解。免疫印迹试验存在杂条带，初步分析这可能是OmpA前体蛋白发生降解的原因，应作进一步研究。

参考文献：

[1]王永坤，田慧芳. 鹅蛋子瘟防治的研究[J]. 中国禽业导刊，2003，20（11）：19-20.

[2]吴立芬. 母鹅卵黄性腹膜炎的发生及防治[J]. 现代农业科技，2009（13）：339.

[3]施馥寿. 控制卵黄性腹膜炎的尝试[J]. 家禽，1985（2）：11.

[4]王尚荣. 鹅卵黄性腹膜炎的诊疗报告[J]. 中国动物检疫，2005，22（4）：39-40.

[5]徐淑华. E.coli的Prlc基因产物对OmpA前体蛋白翻译后转位的功能[J]. 生物化学杂志，1991，6（7）：651-656.

[6]Belaaouaj A，Kim K S，Shapiro S D. Degradation of outer membrane protein A in Escherichia coli killing by neutrophil elastase[J]. Science，2000，289（5482）：1185-1188.

[7]Prasadarao N V，Blom A M，Villoutreix B O，et al. A novel interaction of outer membrane protein A with C4b binding protein mediates serum resistance of Escherichia coli K1[J]. Journal of Immunology，2002，169（11）：6352-6360.

[8]Sukumaran S K，Shimada H，Prasadarao N V. Entry and intracellular replication of Escherichia coli K1 in macrophages require expression of outer membrane protein A[J]. Infection and Immunity，2003，71（10）：5951-5961.

[9]呼 锐，佟春玉，崔玉东.大肠杆菌外膜蛋白A在原核表达载体中的克隆表达[J]. 黑龙江八一农垦大学学报，2011，23（1）：56-59.

[10]Chai T J，Foulds J.Purification of protein A，an outer membrane component missing in Escherichia coli K-12 ompA mutants[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1977，493（1）：210-215.

[11]Morona R，Klose M，Henning U. Escherichia coli K-12 outer membrane protein（OmpA） as a bacteriophage receptor：analysis of mutant genes expressing altered proteins[J]. Journal of Bacteriology，1984，159（2）：570-578.

[12]Pautsch A，Schulz G E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain[J]. Nature Structural Biology，1998，5（11）：1013-1017.

[13]李晓霞，邱玉玉，王海荣. 肠致病性大肠杆菌外膜蛋白免疫保护性研究[J]. 中国免疫学杂志，2007，23（5）：394-397.

[14]宋 舟，陈 伟，张立艳，等. 大肠杆菌外膜蛋白A研究进展[J]. 中国畜牧兽医，2012，39（5）：199-202.