牦牛葡萄糖转运蛋白和单羧酸转运蛋白基因的克隆测序及在肌肉中的表达

金素钰+王国生+徐亚欧+林亚秋+郑玉才

摘要：采用RT-PCR方法克隆九龙牦牛（Bos grunniens）肌肉中葡萄糖转运蛋白（GLUT）和单羧酸转运蛋白（MCT）基因GlUT4、MCT1和MCT4的cDNA序列，并与普通牛（Bos taraus）进行基因序列和肌肉中mRNA水平的比较，以探索牦牛适应高原低氧的分子基础。结果表明，GlUT4、MCT1和MCT4的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与普通牛的相似性均在99.5%以上。实时荧光定量PCR分析显示，成年九龙牦牛与黄牛背最长肌中GLUT4、MCT4基因 mRNA 水平无差别，而牦牛PMCT1基因mRNA水平显著低于黄牛（P<0.05）。乳酸脱氢酶（LDH）总活力和同工酶谱测定结果表明，牦牛背最长肌中LDH总活力、LDH5比例显著高于黄牛，显示出更强的无氧酵解能力。结合MCT1基因mRNA水平的差异发现，牦牛背最长肌对乳酸的氧化代谢能力低于黄牛，更倾向于无氧酵解，与其适应高原低氧有关。

关键词：九龙牦牛；葡萄糖转运蛋白；单羧酸转运蛋白；肌肉；低氧适应；基因表达

中图分类号：S823.8+52 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0029-03

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原特有的牛种，对高寒、低氧等恶劣生态环境有良好的适应性。低氧环境能导致细胞多种能量代谢通路的适应性变化，例如无氧酵解增加，单位葡萄糖产生的能量减少，进而导致细胞膜葡萄糖转运蛋白（GLUT）适应性增加。肌肉组织中最重要的GLUT家族成员包括GLUT1和GLUT4，其中GLUT4是肌肉和脂肪细胞中的主要葡萄糖转运蛋白^[1]，存在于细胞内，受胰岛素、运动和缺氧等因素影响^[2-3]。肌肉是产生乳酸的主要组织，氧化型肌纤维（红肌）和心肌能以乳酸为燃料分子为机体提供能量^[4]。在乳酸转运进入细胞的过程中，单羧酸转运蛋白（MCT）发挥重要作用。MCT有多个家族成员，其中，在肌肉中表达的主要有MCT1、MCT2和MCT4，在乳酸转运中发挥功能^[5-6]。MCT1在氧化型纤维中表达水平高，被认为在乳酸向细胞内转运中发挥重要的作用^[5]。Jurie等研究表明，低氧适应能使肌肉组织在能量代谢方面更依赖于葡萄糖^[7]。因此，分析GLUT、MCT基因序列及其组织表达规律，对认识动物低氧适应的分子机制是重要的切入点。目前，关于暂时性缺氧对GLUT、MCT基因表达影响的研究已有不少，但对于低氧驯化的牦牛组织中GLUT、MCT还未见报道。因此，试验假设长期的低氧适应可能导致牦牛GLUT、MCT基因序列或组织表达水平发生改变，重点分析九龙牦牛GLUT4、MCT1和MCT4的基因序列及其在肌肉中的表达特点，并与普通牛比较，以探索牦牛适应低氧环境的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

试验所用九龙牦牛（Bos grunniens）样品采自四川省甘孜州九龙县，其中，0.5岁犊牛6头，3.5～5.5岁牦牛10头，7～10岁牦牛8头。屠宰时，迅速采集背最长肌和股四头肌，用锡箔纸包好，置于液氮内带回实验室，-80 ℃保存备用。另外，从四川省青白江市某屠宰场采集6头成年黄牛背最长肌和股四头肌样本作为对照。

1.2 试剂及器材

主要仪器包括高速冷冻离心机（日立）、超声波破碎仪（Sonics）、分光光度计（Cary 50，Varian）、电动匀浆器（PT-1200E，Kinematica）、凝胶成像系统（Gel Doc 2000，Bio-Rad）。荧光定量PCR试剂SYBR Premix Ex TaqTM（2×）购自TaKaRa公司；反转录试剂盒购自MBI公司；2×LongTaq Mix、Trizol试剂均购自天根公司。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3 牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因的克隆测序

取RNA 8 μL，用Random hexamer引物按Fermentas反转录试剂盒说明书进行反转录。根据GenBank中普通牛GLUT4、MCT1和MCT4基因mRNA序列（序列号依次为AY458600、BC104598和NM_001109980），用Primer premier 5.0软件设计引物。GLUT4-F：5′-CTAAGACAAGATGCCGTCG-3′，GLUT4-R：5′-TCAGTCATGCTCATCTGG C-3′；MCT1-F：5′-CGAGCCGCGTATAACGAT-3′；MCT1-R：5′-CCACAGGTTCAAACTGGACTCT-3′，MCT4-F：5′-CTTGGAACAGCCTCTGTCA-3′，MCT4-R：5′-GAGCGTTGACGGTCTCTG-3′。预期片段长度：GLUT4为1 540 bp，MCT1为 1 574 bp，MCT4为1 483 bp。PCR反应体系：2×Long Taq Mix 12.5 μL，灭菌水 8.5 μL，正、反引物各1 μL，cDNA 2 μL。PCR条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，53 ℃（GLUT4）/55 ℃（MCT1）/56 ℃（MCT4）1 min，72 ℃ 2 min，共40个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后经胶回收试剂盒纯化，按常规基因克隆技术进行克隆，每个基因的阳性克隆取3～5个菌液送上海英骏生物技术有限公司进行双向测序。

1.4 定量PCR分析牦牛肌肉中GLUT4、MCT1和MCT4 mRNA 水平

根据获得的九龙牦牛3个基因的cDNA序列，用Primer Premier 5.0软件跨内含子设计引物。GLUT4-F1：5′-TGGGGACACTCAATCAACT-3′；GLUT4-R1：5′-TCAGCCAACACCTCAGACA-3′，MCT1-F1：5′-AAACGCTGATGGACCTTG-3′；MCT1-R2：5′-TATGCCACATGCCCAGTA-3′；MCT4-F1：5′-GTCCACTGCCAGCAACTAC-3′，MCT4-R1：5′-AGCACCAGCACAAGGGA-3′。内参基因的引物根据GenBank中普通牛GAPDH序列（NM_001034034）设计，GAPDH-F：5′-CACCCTCAAGATTGTCAGC-3′，GAPDH-R：5′-TCATAAGTCCCTCCACGAT-3′。根据荧光定量PCR试剂盒说明配制20 μL的反应体系，其中，正、反向引物各0.5 μL，cDNA 1 μL。PCR条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，58 ℃（GLUT4、GAPDH）/62 ℃（MCT1、MCT4）10 s，72 ℃ 30 s，共45个循环。采用目的基因、内参基因的质粒作为标准品，制作标准曲线，目的基因的表达水平用内参基因校正。

1.5 肌肉组织LDH总活力及其同工酶谱分析

准确称取0.2 g肌肉组织，加匀浆液（含10 mmol/L Tris、pH值为8.0，0.25 mol/L蔗糖，2 mmol/L EDTA）2.8 mL，用电动匀浆器在冰上匀浆30 s，取1 mL以转速10 000 g于4 ℃离心10 min，参照Marchat等方法^[8]测定上清液LDH活力。酶活力的定义为：在25 ℃条件下，1 g新鲜组织1 min催化 1 μmol 底物转化为1个单位。LDH同工酶采用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，酶活性染色^[9]。

2 结果与分析

2.1 牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因的克隆测序

采用RT-PCR方法扩增九龙牦牛背最长肌的GLUT4、MCT1和MCT4基因，均得到1条特异的扩增条带，并分别均与预期分子量大小相符（图略）。测序结果证实得到了GLUT4、MCT1和MCT4等3个基因的编码序列（CDS序列），并提交GenBank。

由表1可见，牦牛GLUT4基因（HM055486）CDS全长 1 530 bp，编码509个氨基酸，与普通牛相比有5个碱基差异和1个氨基酸差异，牦牛第293位为Val（缬氨酸），而普通牛为Met（甲硫氨酸），核苷酸和氨基酸相似性分别为99.67%和99.8%；牦牛MCT1基因（HM061149）CDS全长1 506 bp，编码501个氨基酸，与普通牛相比有6个碱基差异和2个氨基酸差异，牦牛第325位、354位分别为Iso（异亮氨酸）、Val（缬氨酸），而普通牛分别为Val、Iso，核苷酸和氨基酸相似性均为99.6%；牦牛MCT4基因（HM583655）CDS全长 1 386 bp，编码460个氨基酸，与普通牛相比有6个碱基差异，核苷酸相似性为99.56%，但氨基酸序列完全相同。牦牛3个基因与普通牛的碱基差异类型主要是转换。

2.2 牦牛肌肉GLUT4、MCT1、MCT4基因的发育谱

3个目的基因和内参基因的实时荧光定量PCR标准曲线扩增效率为94.5%～102.9%，符合分析要求。在牦牛背最长肌和股四头肌中，GLUT4、MCT1、MCT4 mRNA水平在各年龄段（0.5、3.5～5.5、7～10岁）均无显著差异。

2.3 牦牛与黄牛肌肉GLUT4、MCT1、MCT4基因表达比较

实时荧光定量PCR分析显示，成年九龙牦牛（n=10）与黄牛（n=8）背最长肌中，GLUT4、MCT4 mRNA水平无差别，MCT1 mRNA水平黄牛显著高于牦牛（P<0.05，图1）；而在股四头肌中，GLUT4、MCT1、MCT4的mRNA水平均未见显著差异。

2.4 肌肉组织LDH活力和酶谱

试验结果表明，牦牛背最长肌中LDH总活力显著高于黄牛[牦牛（510±30） U/mg，黄牛（407±35） U/mg]，而腿肌中LDH总活力接近[牦牛（305±31） U/mg，黄牛（282±47） U/mg]。由图2可见，牦牛背最长肌中LDH5的比例显著高于黄牛，而LDH2比例极显著低于黄牛。股四头肌中LDH同工酶比例无显著差异。

3 结论与讨论

酸序列及推导的氨基酸序列与普通牛相似性很高，均在99.5%以上，与其他很多功能基因研究结果^[10-11]一致，这也说明牦牛与普通牛的亲缘关系很近。牦牛和普通牛存在氨基酸差异的有2个基因GlUT4和MCT1，存在差异的氨基酸性质相似（Val、Iso、Met），推测这些氨基酸的变化对相应载体蛋白功能影响很小，GlUT4、MCT1和MCT4基因序列具有保守性。

年龄增长的变化趋势，发现在骨骼肌中MCT1和MCT4 mRNA水平随年龄增加而发生不同程度的改变^[12]；Kirat等研究发现MCT1在成年牛肝脏的表达量极显著高于犊牛^[13]。本试验结果与Hatta等研究结论存在差异，原因尚不清楚。

有关低氧刺激对GLUT、MCT基因表达影响的研究已有很多报道。Wood等研究发现，低氧能提高人的脂肪细胞GLUT1水平，但不会改变GLUT4水平^[14]。Ullah等研究了体外培养的细胞（HeLa、COS、HL-1）中MCT1、 MCT2、MCT4对缺氧刺激的反应，结果表明，MCT4 mRNA和蛋白质表达水平均增加，MCT1和MCT2水平未见变化^[15]。本研究中由于牦牛对低氧的长期驯化，相关能量代谢机制可能与暂时性缺氧有所不同。

MCT1在氧化型纤维中表达水平高，帮助乳酸向细胞内转运，参与乳酸的氧化利用^[5]。McCullagh等研究了MCT1的表达，证实MCT1在红肌的表达与肌肉中乳酸吸收相关，与柠檬酸合成酶活性呈相关（肌肉氧化能力的标志），这说明MCT1能促进肌纤维细胞对乳酸的吸收，与LDH（心型）及氧化代谢相关酶协同表达^[16]。由于LDH参与无氧酵解，而且LDH5倾向于将丙酮酸还原成乳酸^[17]。九龙牦牛背最长肌中MCT1 mRNA表达量显著低于黄牛，背最长肌中LDH总活力、LDH5比例显著高于黄牛，这说明牦牛背最长肌糖代谢中乳酸的氧化低于黄牛，更倾向于无氧酵解，与牦牛生活环境中的氧含量是相适应的。然而，由于肌肉组织中可表达多种MCT^[18]，因此，牦牛和黄牛对乳酸的利用及其转运的分子基础比较，需要更加精细和全面的分析。

本试验结果初步表明，牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因序列与普通牛相似性高；与普通牛比较，牦牛背最长肌中较低的MCT1 mRNA水平与其较强的无氧代谢能力相吻合，可能是牦牛从分子水平上适应低氧环境的表现之一。

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