野牛草基因组DNA提取方法的筛选

张晓波+许沛东+赵艳

摘要：采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、十二烷基磺酸钠（SDS）法以及高盐法3种方法对野牛草叶片的基因组DNA进行提取，并利用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测比较3种方法提取DNA的纯度与浓度。结果表明，3种方法提取到的野牛草叶片DNA的纯度、完整性都较好，质量从高到低依次为CTAB法>高盐法>SDS法，产率依次为SDS法>CTAB法>高盐法，综合来看CTAB法是提取野牛草基因组DNA的最佳方法。

关键词：野牛草；DNA提取；CTAB法；SDS法；高盐法

中图分类号：S688.403 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0026-03

野牛草是广泛种植于我国西北、华北及东北地区的暖季型草坪草，在20世纪50年代初由中科院胡淑良先生从美国引进^[1-2]。野牛草耐旱性强，在年降水量300～600 mm的干旱、半干旱地区也可以正常生长，在持续干旱2～3个月的夏季生长状况依旧良好。野牛草喜pH值为6.1～8.0的黏质土壤，但在高原丘陵瘠薄土壤上也可顽强生长；野牛草具有较强的耐寒性，在我国北方大部分地区都可越冬，甚至在西北、东北的寒冷地带-39°C的低温条件下也可以正常越冬^[3-6]。由于野牛草良好的抗逆性，应用广泛，对其研究也越来越多，但主要集中在品种选育^[7-9]和抗逆性[3，10-12]的研究方面，而对野牛草基因组DNA的研究相对较少。然而，对于我国这个水资源平均占有量不足世界平均水平1/4，被联合国列入世界13个贫水国之一的国家来说^[13]，收集优质草坪种质材料，对其生物学特征及遗传多样性进行分析鉴定研究，筛选具有观赏价值和节水环保作用的草坪品种，有着广泛的应用前景和现实意义的。关于植物基因组DNA提取方法，国内外都有一定的研究，包括高粱等作物^[14]、红掌等花卉^[15]以及狗牙根等草坪草^[16-17]。本试验结合国内外相关研究，参考Staub等的研究方法^[18-20]，针对野牛草的特性，如叶片纤维含量高，具有绒毛、韧性高的特点，对适合基因组DNA提取的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、十二烷基磺酸钠（SDS）法、高盐法3种方法进行比较，筛选出最佳方法。旨在为野牛草未来的遗传多样性研究提供一定的参考，同时也为适应我国城市绿化以及西部生态环境建设的需要，培育适合我国国情的环保型耐旱草坪植物奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为中国农业科学院畜牧研究所培育的野牛草品系植株。

1.2 试验方法

1.2.1 野牛草基因组DNA的提取方法

CTAB法：（1）取野牛草叶片3～5 g，用蒸馏水洗净，吸干表面水珠后置于 1.5 mL 离心管中，加入适量液氮致冷，研成细粉；（2）吸取 900 μL 提前预热到65 ℃的CTAB提取液加入到样品中混匀；（3）将离心管放入水浴槽中，在65 ℃的温度下浸提15～20 min，每 2 min 取出充分混匀；（4）取出冷却后，加入500 μL三氯甲烷-异戊醇（24 ∶1），振荡5 min；（5）在6 000～8 000 r/min 下离心10 min；（6）弃上清液，重复4～5步；（7）取出上清液后，加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀至出现白色絮状沉淀；（8）在12 000 r/min下离心5 min，弃上清液；（9）用75%乙醇清洗2次，在室温干燥1 h后溶入200 μL的TE缓冲液（2 mol/L Tris-HCl；0.5 mol/L EDTA），在4 ℃的温度条件下保存备用。

SDS法：（1）取叶片0.05～0.1 g，置于1.5 mL离心管中，适量液氮冷冻后研磨成粉；（2）加入400 μL预热至 65 ℃ 的缓冲液（100 mmol/L Tris-Cl，pH值8.0；50 mmol/L EDTA；500 mmol/L NaCl；15 mg/mL SDS；10 mmol/L 2-巯基乙醇；30 mg/mL PVP）；（3）混匀后置于65 ℃的水浴中0.5～1 h；（4）冷却后，加入1/3体积的5 mol/L KAC，置于冰箱 10 min，取出后再加入1/3体积的三氯甲烷/异戊醇，混匀后离心 10 min；（5）将上清移至另1支加入了等体积预冷异丙醇的离心管中，轻轻混匀，在13 000 r/min下离心10 min；（6）弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀2次，在室温下干燥；（7）加入 50 μL TE 溶解沉淀，经RNase酶消化后保存备用。

高盐法：（1）取0.05～0.1 g 叶片，加入液氮研成粉末后分装于1.5 mL的离心管中；（2）加入400 μL DNA 高盐提取缓冲液（200 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0；2 mmol/L NaCl；70 mmol/L EDTA，pH值8.0），加入100 μL 5%肌氨酸钠，混匀；（3）放入65 ℃水浴锅中保温30 min，其间翻转离心管2～3次；（4）冷却后在13 000 r/min 离心15 min，取上清液至新离心管中，加入RNase酶37 ℃保温30～60 min；（5）然后加入等体积三氯甲烷/异戊醇（24 ∶1），混匀，13 000 r/min下离心 10 min；（6）取上清液至新的离心管中，加入0.2倍体积的 10 mol/L NH4Ac和0.7倍体积的异丙醇，混匀，放入-20 ℃冰箱中静置30 min；（7）在13 000 r/min下离心15 min，弃上清，倒置离心管1 min；（8）加入70%乙醇500 μL洗涤，在 13 000 r/min 下离心2～3 min，弃上清液，重复洗净2次，于室温下晾干；（9）加入30～50 μL TE，65 ℃水浴中溶解 30 min，放入-20 ℃的冰箱中保存备用。

1.2.2 基因组DNA纯度检测

制备0.8%琼脂糖凝胶，取DNA 2 μL，在1×TAE缓冲液、电场强度3～5 V/cm条件下电泳60～90 min。放入紫外灯下观察、拍照，观察点样孔及整个泳道，判断DNA样品纯度。

1.2.3 基因组DNA总浓度测定

将4 μL DNA样品和 396 μL TE混匀后，放入分光光度计中测量并记录DNA样品D260 nm/D280 nm值以及DNA浓度，若D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之间时，说明DNA样品纯度好，适于作RAPD分析。同时根据D260 nm值为1的DNA样品浓度为50 ng/μL计算DNA浓度，计算公式为：

2 结果与分析

2.1 DNA电泳检测结果

采用0.8%琼脂糖凝胶电泳对用CTAB等3种方法提取的DNA分别进行纯度检测，结果（图1）表明，3种方法所提取到的DNA谱带亮度差异不明显，观察DNA泳道，背景都比较清晰，说明DNA的完整性较好，蛋白质、RNA及其他杂质均比较少，可以满足RAPD试验的要求。检测结果表明3种方法都可用于野牛草基因组DNA的提取。

2.2 DNA总浓度测定结果

试验用3种不同提取方法均得到了野牛草叶片的基因组DNA，但在纯度和产率上有一定的差别。如表1所示，SDS法产率最高，达到310～375 ng/mg之间，但其质量最差，D260 nm/D280 nm 值为1.25～1.60，若想达到试验要求还须继续纯化；CTAB法所提DNA质量最好，D260 nm/D280 nm比值为 1.76～1.94，且产率较高，达到240～360 ng/mg；高盐法所提DNA质量和产率均处于CTAB法和SDS法之间，D260 nm/D280 nm 值为1.57～1.82，产率为230～360 ng/mg。综合来看，3种方法提取到的野牛草叶片DNA的纯度、完整性都较好，但CTAB法提取的D260 nm/D280 nm比值最高，所以CTAB法是提取野牛草基因组DNA的最佳方法。

3 结论与讨论

获得一定数量和质量的DNA样品，是进行PCR等分子生物学试验的前提。目前，根据研究目的和研究对象的差异，国内外研究者往往都采取不同的DNA提取方法^[21-27]。其中有使用较通用方法的，也有针对某一具体物种或针对含多糖、多酚等次生代谢物植物而使用改良方法的。而如果所提取的DNA样品用于PCR分析，则DNA提取的步骤越少越好，否则多步骤多试剂容易造成交叉污染，而PCR极其灵敏，步骤繁多容易影响PCR的准确性^[26]。

本试验针对野牛草叶片纤维含量较高，具有绒毛、韧性高等特点，设计采用CTAB法、SDS法以及高盐法分别提取到了野牛草基因组DNA，并对3种方法进行比较，对所得DNA的浓度和纯度进行了检测。结果表明，3种不同的方法均可提取野牛草叶片的基因组DNA，但在纯度和产率上却有着明显的差别。SDS法产率最高，但质量最差，D260 nm/D280 nm值为1.25～1.60，需要继续纯化才能用于RAPD反应；CTAB法所提取到的DNA质量最好，颜色为白色，D260 nm/D280 nm值为 1.76～1.93，且产率较高，可达240～355 ng/mg；高盐法所提取得到的DNA质量和产率均介于其他2种方法之间。

所述，CTAB法、SDS法以及高盐法提取的野牛草叶片基因组DNA的纯度和完整性都较好，其中以CTAB法提取的DNA D值最高。因此，提取野牛草基因组DNA的最佳方法是CTAB法。

但是，在利用CTAB法提取野牛草基因组DNA时，需要注意以下几点问题：（1）野牛草叶片的纤维含量较高，且具有绒毛、韧性高等特点，短时间的研磨不能完全破坏野牛草叶片细胞的细胞壁，所以在提取过程用液氮研磨时一定要充分；（2）CTAB缓冲液一定要现配现用，并且为了使其更好地发挥裂解作用，一定要预热，并在缓冲液中加入2% PVP；（3）在研磨前加入2% β-巯基乙醇。如果在温度过高的季节提取，要尽量使用超低温离心机；（4）机械张力极其容易造成DNA分子的断裂，所以在抽提过程中，要小心操作；此外，为获得较高浓度的DNA，可以在吸取上清液减少的前提下，尽量减少抽提次数。

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