植物茎尖分生组织中的干细胞调控机制研究进展

2014-10-23陈菊移王鹏凯陈金慧施季森

江苏农业科学 2014年8期

陈菊移+王鹏凯+陈金慧+施季森

摘要：茎尖分生组织干细胞是植物地上部分生长发育的基础。复杂的基因调控网络和信号传导途径使干细胞维持着细胞分裂和分化的平衡。对拟南芥的研究显示，WUS/CLV3反馈抑制调节机制在干细胞基因调控网络中发挥着重要作用，且在植物中具有一定保守性；大量转录因子和染色体重塑因子在转录水平通过调控WUS从而对干细胞活动进行调节；植物生长调节物质也参与调控茎尖分生组织的生长活动，主要通过KNOX基因家族发挥作用。茎尖分生组织的分子调控网络中存在大量反馈抑制调节途径，这种调节形式反映了植物体的动态调节能力和平衡维持机制。

关键词：茎尖分生组织；干细胞；WUS/CLV3；反馈调节

中图分类号：Q942.6 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0011-04

植物茎尖分生组织（shoot apical meristem，SAM）是植物地上部分生长发育的基础，其中包含的干细胞（SC）通过分裂（进行自身更新并维持一定的细胞数量）和分化（指导一部分细胞输出分生组织并发育成各种器官）形成了植物地上部分的各个器官。这2种细胞行为使干细胞和分化细胞在数量上保持动态平衡^[1]，保证了植物生长发育过程的可塑性。SAM干细胞区是一个相对独立的结构，其中的细胞保持未分化的状态并接受来自临近细胞的信号。在基因调控和细胞信号的影响下，干细胞一部分进行分裂保持干细胞数量，而另一部分移出该干细胞区域进行分化。分子遗传学、分子生物学和模式植物拟南芥研究的不断深入使SAM干细胞基因调控途径逐渐清晰。研究发现茎尖分生组织中心标记基因WUSCHEL（WUS）和干细胞标记基因CLVATA3（CLV3）^[2]之间的反馈调节机制在分生组织干细胞区确定和维持方面起决定性作用。大多数对植物地上部分生长发挥作用的基因都是通过直接或间接影响WUS/CLV3反馈抑制途径发挥作用。

[WTHZ]1 SAM结构

植物SAM大约含有500个细胞，这些细胞可分为不同的区域和细胞层。SAM穹顶状结构自上而下的3层细胞（图1）称为L1、L2、L3层细胞：L1层细胞发育成表皮；L2层细胞发育成叶肉；L3层细胞形成叶和茎的内部组织^[3-4]。大多数双子叶植物SAM中有L1和L2层，大多数单子叶植物SAM中只有L1层细胞^[5]。中心区（含有干细胞和组织中心）和周边区（分化侧生器官）在L1至L3细胞层上横向排列^[5]，而肋状区（为茎生长提供细胞）则位于组织中心下方（图1）。中心区细胞数量稳定且分裂速度缓慢，拟南芥CLV3表达分析结果显示拟南芥中心区大约含有35个干细胞^[6-7]。周边区可以进一步分为外周边区和内周边区。内周边区细胞可通过脱分化恢复到干细胞状态，外周边区细胞一旦进入分化途径后无法完成脱分化。与中心区不同，周边区细胞分裂迅速，可为器官原基的形成提供大量细胞，保证植物正常生长。

2 拟南芥SAM组织中心标记基因WUS及其调控基因

拟南芥SAM中大约有10个细胞表达WUS基因，这些细胞位于中心区L3层和更下层，组成的区域称为组织中心（图1）。WUS编码1个转录因子，WUS功能丧失可使干细胞在形成器官原基的过程中消失，SAM活动过早停止^[8]；WUS过表达会形成过多的干细胞，因此拟南芥SAM中WUS的表达可以维持干细胞数目，保证干细胞区域细胞分裂与分化之间的平衡。现有研究结果已经证明WUS基因表达产生的信号经过运输进入干细胞中发挥作用^[9]。

WUS的表达受到众多转录因子、染色质重塑因子的调控（包括正调控和负调控），这些因子在维持WUS持续表达的同时也将其表达区域限制在组织中心。目前大多数调控因子对WUS的调控机制和途径仍不清晰，但已发现WUS启动子中存在能够保证WUS准确表达的序列^[10]，说明WUS表达调控过程中可能存在转录激活复合体，该复合体能够联合多个信号途径对WUS进行表达调控^[11]。WUS启动子中的一个57 bp区域（位于转录起始位点上游550 bp）能够维持WUS在组织中心的正常时空表达模式。这个区域中有2个相邻的短序列在WUS的转录调控过程中发挥作用。众多调节信号相互作用后和这2个序列相互结合从而调控WUS的转录。

2.1 WUS的直接调控因子

迄今为止发现的能够与WUS启动子直接作用的基因是染色体重塑因子BRCA1-ASSOCIATED RING DOMAIN1（BARD1）和SPLAYED（SYD）。WUS表达的激活受到SPLAYED（SYD）染色质重塑因子的直接调控，SYD编码一种ATP酶，可促进DNA模板形成转录结构而启动转录^[12-13]。BARD1编码的蛋白具有磷酸化依赖性，在SAM结构的维持方面发挥功能。BARD1突变使WUS只在组织中心边缘表达，破坏SAM结构。BARD1蛋白不仅与WUS启动子存在直接作用，还与SYD之间有互作关系，说明BARD1通过抑制染色质重塑过程影响WUS表达^[14]。

2.2 WUS的间接调控因子

WOX9是WUS表达的正调控基因，其突变体表型为SAM功能丧失，WUS和CLV3表达量降低。遗传分析结果表明WOX9在促进WUS表达的同时也受到CLV3的负调控，三者可以形成辅助性的负反馈调节途径^[5]。

APETALA2（AP2）是花发育ABC模型中的A功能基因，现有研究结果说明AP2可能在WUS上游起正调控作用。AP2突变表型也是SAM活动过早停止^[17]。OBERON1（OBE1）和OBERON2（OBE2）是AP2的功能冗余基因^[11]，这2个基因的双突变体表现出SAM活动停止，WUS和CLV3表达水平降低。说明这2个基因具有维持干细胞特性的功能。

MERISTEM DEFECTIVE（MDF）编码的蛋白可能在转录调控和RNA加工过程中对WUS表达发挥正调控作用。研究证明mdf突变体表型为SAM活动停止，WUS表达量降低；MDF过表达会导致异位分生组织形成^[18]。

ULTRAPETALA1（ULT1）和HANABA TARANU（HAN）是WUS的负转录调控因子。ULT1在生长发育后期对WUS表达起到负调控作用。ULT1在发育中的花器官和胚分生组织中表达，ult1表型为花序和花分生组织膨大，说明ULT1在花形成过程中对WUS表达调控起重要作用。HAN是GATA-3类转录因子，可控制表达WUS基因细胞的数目，使分生组织中心区和器官原基之间形成分界线^[19]。

质谱结果显示出成熟的CLV3编码产物含有1个分泌型糖肽（13个氨基酸）和2个羟脯氨酸残基^[22-23]，在翻译后加工过程中1个羟脯氨酸残基发生了糖基化反应，对其生理功能和生物活性起决定作用，未发生糖基化反应的CLV3编码产物生物学活性和受体结合活性都非常低^[22-23]。CLV3在L1至L3层的干细胞中表达，其翻译产物在细胞中以信号分子的形式向下扩散，可以被CLV1受体激酶和CLV2/CRN受体激酶复合物传递而发挥功能^[24]。

CLV3作为信号分子通过CLV1、CLV2、CORYNE（CRN）共同组成通路向下传递，对WUS的表达发挥抑制作用^[24]。受体激酶CLV1的亮氨酸富集结构域可以结合CLV3；无激酶活性的受体CLV2必须与激酶CORYNE（CRN）结合后才能形成功能复合体结合CLV3。CLV1、CLV2、CRN具有跨膜结构域，可以固定到质膜上，其中CLV1可以自身形成二聚体，CLV2/CRN形成四聚体，CLV1、CLV2也可以在CRN的介导下形成CLV1/CRN/CLV2六聚体[25，26]。CLV1、CLV2、CRN组成的大量信号通路保证了CLV3信号的传递效率。

CLVATA3（CLV3）基因在SAM干细胞区特异表达，与WUS的表达在L3层中重合。clv3表型为WUS表达区域的扩大，SAM膨大。CLV3过表达使SAM活动过早停止^[9]，与wus表型类似。这说明组织中心标记基因WUS能够促进CLV3表达，而CLV3可以抑制WUS表达。二者形成1个负反馈调节环，成为SAM中干细胞区基因调控网络的中心环节。WUS表达形成的信号因子转运至干细胞并在干细胞中梯度分布而维持干细胞活性，内周边区的细胞能接受这种信号因子发生脱分化回到干细胞状态，从而维持干细胞数量的稳定。

4 WUS和CLV3在不同植物SAM中的功能保守性

除拟南芥外，WUS和CLV3基因也在其他植物SAM干细胞调控中发挥作用。许多双子叶植物中已经发现了WUS的同源基因，这些基因在功能上有保守性。其突变体与拟南芥wus突变体表型类似，即SAM活动的过早停止^[27-30]。已经发现的双子叶植物WUS同源基因都在SAM的组织中心表达。

单子叶植物水稻、玉米和短柄草中也发现了WUS的同源基因，但这些基因在功能上具有多样性。玉米ZmWUS1/2和水稻OsWUS营养生长时期表达区域主要集中于分生组织周边区域和叶原基，SAM中只有短暂表达；生殖生长时期这3个基因与拟南芥CLV1同源基因在SAM中同步表达^[25]。ZmWUS1/2和OsWUS表达模式说明了单子叶植物茎构造和叶片发育过程的特殊性，暗示着单子叶植物中可能存在不同于WUS/CLV3的干细胞调控途径。被子植物和裸子植物的WUS/WOX基因家族分析说明WUS的原始功能可与侧生器官原基发生相关。虽然拟南芥WUS功能模式在其他植物中通用性不强，但是该基因的功能可能具有一定的保守性^[25]。

CLE基因家族是植物中最广泛存在的基因家族^[23]，水稻、玉米、大豆、杨树、苜蓿等甚至苔藓和藻类中都发现了CLE基因^[31-32]。水稻FLORAL ORGAN NUMBER1（FON1）是CLV1同源基因，其突变体表型为分生组织的扩大和花器官数量的增多。FON2和FCP1（FON2-LIKE CLE PROTEIN1）是CLV3的同源基因，其中FON2和FON1共同发挥维持SAM和花序分生组织的功能，FCP1在SAM和RAM中发挥维持分生组织细胞分裂的功能。水稻FON2和FCP1在功能上已产生分化，分别调控不同的分生组织行为。玉米的CLV1和CLV2同源基因是THICK TASSEL DWARF1（TD1）和FASCIATED EAR2（FEA2）。玉米中这2个基因的缺失对分生组织维持和花器官数量都没有影响，表达分析显示TD1没有在分生组织中表达^[26]。这说明CLE基因在单子叶植物分生组织中也发挥作用，但信号机制和功能已经发生变化。这种功能变化在双子叶植物中也同样存在：苜蓿SUPERNUMERIC NODULES（SUNN）和百脉根HYPERNOD-ULATION ABERRANT ROOT 1（HAR1）是CLV1的同源基因，其功能不是维持分生组织而是促进根瘤形成。这2个基因的突变体表型都是根瘤数量增加，分生组织没有变化^[32]。

5 KNOX基因家族和植物激素对SAM活动的调控作用

SHOOT MERISTEMLESS（STM）是独立于WUS/CLV3途径在SAM干细胞维持中发挥重要功能的转录因子，编码Class I KNOX（knotted1-like homeobox）家族的蛋白^[33]。STM在分生组织的各个部位表达，发挥抑制细胞分化的作用^[34]。SAM中STM和WUS的作用互补：STM阻止细胞分化，WUS使一部分细胞特化为干细胞。STM和WUS的共同作用保持着SAM中干细胞增殖和器官原基形成的平衡，是维持SAM正常活动的重要保证^[35]。

植物生长调节物质中的生长素和分裂素在植物茎尖、根尖中作用相反。细胞分裂素在促进茎尖中细胞分裂的同时也促进根尖中细胞的分化；生长素促进根尖中细胞分裂和茎尖中细胞分化。SAM中周围区域高水平的生长素和赤霉素（GA）与侧生器官原基的生长点紧密相连。高水平的细胞分裂素（CK）主要集中在SAM的中央区域中，促进干细胞分裂和维持脱分化状态^[36]。SAM中STM所属的KNOX转录因子家族基因发挥促进细胞分裂素积累和抑制赤霉素积累的作用。这2种植物激素积累分别可以促进细胞分裂和阻止细胞分化。KNOX通过抑制GA20氧化酶活性和刺激GA2氧化酶活性这2个单独的过程阻止赤霉素在SAM的中心区域积累。KNOX基因能够促进叶原基基部GA2氧化酶的表达使赤霉素失活，将激活型赤霉素限制在叶原基中，因此KNOX基因通过阻止赤霉素在SAM中心区域积累而抑制干细胞分化^[37]。

细胞分裂素信号可以促进A型反应调节因子ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS（ARRs）基因的转录，二者之间形成一个负反馈调节系统。WUS直接抑制细胞分裂素应答调控因子ARR7在SAM中的表达，以一种非常精确的方式控制细胞分裂。玉米A型反应调节因子ABPHYL1基因在叶原基基部表达，对叶片发育过程中的细胞分裂素应答起到缓冲作用。水稻LONELY GUY（LOG）基因编码产物可将失活性细胞分裂素转变为激活型细胞分裂素^[38]，该基因在SAM顶端干细胞部位特异性表达。拟南芥中已经克隆出LOG同源基因，已经证明该基因和LOG具有相似的表达模式^[6]。

SAM的周围区域（PZ）中，干细胞和器官发生处于一种平衡状态。KNOX和促进叶器官形成的转录因子ASYMMETRIC LEAVES相互作用维持着这种平衡状态。ASYMMETRIC LEAVES1（AS1）属于MYB家族的转录因子，AS2是植物特有的LATERAL ORGAN BOUNDARY DOMAIN（LBD）基因家族成员。AS1/2在叶原基形成过程中表达，对BP、KNAT2和KNAT6表达起到抑制作用。除拟南芥外，在玉米和金鱼草中也发现了相似的基因互作模式^[39]。叶原基中的表观遗传调控由GENERAL TRANSCRIPTION FACTOR GROUP E6（GTE6）实现，该蛋白直接调控AS1表达。组蛋白H3/H4的蛋白伴侣可以和AS1/2蛋白结合形成染色体重塑复合物抑制侧生器官原基中KNOX基因的表达。as1/2突变体中KNOX基因的异位表达可以在叶片中形成分生组织[34，37]，因此KNOX的准确表达是影响叶正常发育的重要因素。

6 展望

SAM的调控信号网络十分复杂，其中包含许多调控因子和相互交叉的调控途径。如果将已有的互作网络绘制成一个调控模型，可以看出WUS位于该模型的中心，是SAM中干细胞调控的主要调控因子。同样，KNOX调控途径可以认为是控制分化的中心调控途径。WUS/CLV3和STM/KNOX途径在维持SAM正常功能方面共同起决定性作用。而STM/KNOX途径和WUS/CLV3途径又通过植物激素相互作用，保证SAM顶端处于一个高细胞分裂素低赤霉素的环境。与WUS/CLV3同时存在的其他反馈调节途径也在SAM中发挥重要作用，它们通过负反馈调节功能共同维持干细胞内环境稳定。

可以从2个角度去理解为何植物SAM调控需要大量的调控因子参与。一是必须有大量的功能冗余因子存在，保证某个因子功能丧失时同样可以维持SAM正常活动；二是持续形成干细胞保证形态建成的过程需要许多信号系统进行辅助调节以维持分裂分化平衡。对参与SAM调控的因子进行详细的时空动态表达分析，可以对干细胞增殖和分化行为进行详细说明，同时可以对已知途径进行修正，而不同途径的相互联系则需要更多的证据进行补充。

参考文献：

[1]Haecker A，Laux T. Cell-cell signaling in the shoot meristem[J]. Current Opinion in Plant Biology，2001，4（5）：441-446.

[2]Laux T，Mayer K，Berger J，et al. The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis[J]. Development，1996，122（1）：87-96.

[3]Weigel D，Jürgens G. Stem cells that make stems[J]. Nature，2002，415（6873）：751-754.

[4]Williams L，Fletcher J C. Stem cell regulation in the Arabidopsis shoot apical meristem[J]. Current Opinion in Plant Biology，2005，8（6）：582-586.

[5]Kim C，Liu L，Kim J. Signaling network for stem cell maintenance and functioning in Arabidopsis shoot apical meristem[J]. Journal of Plant Biology，2007，50（3）：274-281.

[6]Yadav R K，Girke T，Pasala S，et al. Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106（12）：4941-4946.

[7]Venugopala R G. Live-imaging stem-cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex[J]. Current Opinion in Plant Biology，2008，11（1）：88-93.

[8]Schoof H，Lenhard M，Haecker A，et al. The stem cell population of Arabidopsis shoot meristems is maintained by a regulatory loop between the CLAVATA and WUSCHEL genes[J]. Cell，2000，100（6）：635-644.

[9]Reddy G V，Meyerowitz E M. Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex[J]. Science Signaling，2005，310（5748）：663.

[10]Burle I，Laux T. Regulation of WUSCHEL transcription in the stem cell niche of the Arabidopsis shoot meristem[J]. The Plant Cell Online，2005，17（8）：2271-2280.

[11]Saiga S，Furumizu C，Yokoyama R，et al. The Arabidopsis OBERON1 and OBERON2 genes encode plant homeodomain finger proteins and are required for apical meristem maintenance[J]. Development，2008，135（10）：1751-1759.

[12]Shen W H，Xu L. Chromatin remodeling in stem cell maintenance in Arabidopsis thaliana[J]. Molecular Plant，2009，2（4）：600-609.

[13]Long J A，Moan E I，Medford J I，et al. A member of the KNOTTED class of homeodomain proteins encoded by the STM gene of Arabidopsis[J]. Nature，1996，379（6560）：66-69.

[14]Han P，Li Q，Zhu Y X. Mutation of Arabidopsis BARD1 causes meristem defects by failing to confine WUSCHEL expression to the organizing center[J]. The Plant Cell Online，2008，20（6）：1482-1493.

[15]Kim Y S，Kim S G，Lee M，et al. HD-ZIP Ⅲ activity is modulated by competitive inhibitors via a feedback loop in Arabidopsis shoot apical meristem development[J]. The Plant Cell Online，2008，20（4）：920-933.

[16]Prigge M J，Clark S E. Evolution of the class Ⅲ HD-Zip gene family in land plants[J]. Evolution & Development，2006，8（4）：350-361.

[17]Wurschum T，Groβ-Hardt R，Laux T. APETALA2 regulates the stem cell niche in the Arabidopsis shoot meristem[J]. Science Signaling，2006，18（2）：295.

[18]Casson S A，Topping J F，Lindsey K. MERISTEM‐DEFECTIVE，an RS domain protein，is required for the correct meristem patterning and function in Arabidopsis[J]. The Plant Journal，2009，57（5）：857-869.

[19]Zhao Y，Medrano L，Ohashi K，et al. HANABA TARANU is a GATA transcription factor that regulates shoot apical meristem and flower development in Arabidopsis[J]. The Plant Cell Online，2004，16（10）：2586-2600.

[20]Zhu H，Hu F，Wang R，et al. Arabidopsis Argonaute10 specifically sequesters miR166/165 to regulate shoot apical meristem development[J]. Cell，2011，145（2）：242-256.

[21]Jung J H，Park C M. MIR166/165 genes exhibit dynamic expression patterns in regulating shoot apical meristem and floral development in Arabidopsis[J]. Planta，2007，225（6）：1327-1338.

[22]Dodsworth S. A diverse and intricate signalling network regulates stem cell fate in the shoot apical meristem[J]. Developmental Biology，2009，336（1）：1-9.

[23]Ohyama K，Shinohara H，Ogawa-Ohnishi M，et al. A glycopeptide regulating stem cell fate in Arabidopsis thaliana[J]. Nature Chemical Biology，2009，5（8）：578-580.

[24]Miwa H，Kinoshita A，Fukuda H，et al. Plant meristems：CLAVATA3/ESR-related signaling in the shoot apical meristem and the root apical meristem[J]. Journal of Plant Research，2009，122（1）：31-39.

[25]Sawa S，Kinoshita A，Betsuyaku S，et al. A large family of genes that share homology with CLE domain in Arabidopsis and rice[J]. Plant Signaling & Behavior，2008，3（5）：337.

[26]Yamamoto E，Karakaya H C，Knap H T. Molecular characterization of two soybean homologs of Arabidopsis thaliana CLAVATA1 from the wild type and fasciation mutant[J]. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Structure and Expression，2000，1491（1）：333-340.

[27]Reinhardt D，Frenz M，Mandel T，et al. Microsurgical and laser ablation analysis of interactions between the zones and layers of the tomato shoot apical meristem[J]. Development，2003，130（17）：4073-4083.

[28]Stuurman J，Jggi F，Kuhlemeier C. Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells[J]. Genes & Development，2002，16（17）：2213-2218.

[29]Tan F C，Swain S M. Functional characterization of AP3，SOC1 and WUS homologues from citrus（Citrus sinensis）[J]. Physiologia Plantarum，2007，131（3）：481-495.

[30]Nardmann J，Reisewitz P，Werr W. Discrete shoot and root stem cell-promoting WUS/WOX5 functions are an evolutionary innovation of angiosperms[J]. Molecular Biology and Evolution，2009，26（8）：1745-1755.

[31]Hake S. The interaction of knotted1 and thick tassel dwarf1 in vegetative and reproductive meristems of maize[J]. Genetics，2009，181（4）：1693-1697.

[32]Elise S，Etienne-Pascal J，de Fernanda C N，et al. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length[J]. Plant Molecular Biology，2005，58（6）：809-822.

[33]Gallois J L，Woodward C，Reddy G V，et al. Combined SHOOT MERISTEMLESS and WUSCHEL trigger ectopic organogenesis in Arabidopsis[J]. Development，2002，129（13）：3207-3217.

[34]Veit B. Hormone mediated regulation of the shoot apical meristem[J]. Plant Molecular Biology，2009，69（4）：397-408.

[35]Kurakawa T，Ueda N，Maekawa M，et al. Direct control of shoot meristem activity by a cytokinin-activating enzyme[J]. Nature，2007，445（7128）：652-655.

[36]Su Y H，Liu Y B，Zhang X S. Auxin-cytokinin interaction regulates meristem development[J]. Molecular Plant，2011，4（4）：616-625.

[37]Bleckmann A，Simon R. Interdomain signaling in stem cell maintenance of plant shoot meristems[J]. Molecules and Cells，2009，27（6）：615-620.

[38]Byrne M E，Simorowski J，Martienssen R A. ASYMMETRIC LEAVES1 reveals knox gene redundancy in Arabidopsis[J]. Development，2002，129（8）：1957-1965.

[39]Byrne M E，Barley R，Curtis M，et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis[J]. Nature，2000，408（6815）：967-971.