炎症因子IL-23对黑色素瘤B16F10细胞增殖和侵袭能力的影响

田 原，马跃美，刘艳荣，房东亮，赵秀兰

（天津医科大学1.外科手术学教研室；2.病理学教研室，天津300070）

白细胞介素-23（IL-23）在炎症和自身免疫性疾病中具有重要的调节作用，目前研究表明IL-23可通过调控肿瘤微环境中的炎症反应[1]，从而促进肿瘤的发生与侵袭迁移[2]。有关炎症因子IL-23对黑色素瘤细胞增殖和侵袭力的直接影响少见报道。本研究在前期研究慢性炎症与肿瘤关系的基础上，通过体外实验探讨IL-23对黑色素瘤B16细胞增殖和侵袭能力的影响，为进一步研究IL-23在慢性炎症与肿瘤发生发展中所发挥的作用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠黑色素瘤细胞株B16F10由天津医科大学病理学教研室冻存。重组鼠IL-23购自美国PeproTech公司，Transwell小室（直径为 8μm）购自Invitrogen公司，MTT购自美国Sigma公司，Matrigel胶购自美国BD公司，细胞培养板购自美国Costar公司，胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司。兔抗鼠NF-κB磷酸化P65一抗购自美国Santa Cruze公司，兔抗鼠β-actin一抗、山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 小鼠黑色素瘤细胞B16F10，接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中（加入青霉素、链霉素各100 U/m L），置于37℃、5%CO2培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化传代。所有实验均用对数生长期的细胞。

1.2.2 MTT法检测B16细胞的增殖能力 将B16细胞制备成1×104/mL单细胞悬液，按每孔200μL接种于96孔培养板，培养24 h后在培养液中加入终浓度为10 ng/mL的IL-23，并设空白对照组，在培养箱中分别放置24、48、72、96 h后，加入MTT 100 μL培养4 h，吸弃液体，每孔加入100μLDMSO充分溶解15min。用酶标仪于490 nm处测吸光度值(A值)，结果为5复孔的平均值。

1.2.3 Transwell侵袭实验检测B16细胞的侵袭能力 用 50 mg/LMatrigel胶 1∶8稀释液包被 Transwell小室的上室面，37℃孵育过夜。实验前细胞用无血清培养基培养过夜，次日消化重悬细胞，于下室加入含10%胎牛血清的培养基、上室中加入无血清和浓度为10 ng/mL IL-23的B16细胞悬液各200 μL，并设空白对照组，在培养箱中培养48 h后取出小室，PBS淋洗，擦去上室中细胞，95%酒精固定10 min，4 g/L结晶紫染色，PBS清洗，200倍倒置显微镜下拍照穿膜细胞，随机选10个视野，计算平均数。实验重复3次，每组各设3复孔。

1.2.4 明胶酶谱检测B16细胞MMP-2和MMP-9的表达活性 将无血清的B16细胞接种到24孔板，每孔500μL，培养24 h后，在培养液中加入10 ng/mL IL-23，培养48 h后，收集上清液，12 000 r/min，离心10min，进一步取上清液进行明胶酶谱检测。以含0.1%明胶的10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳至溴酚兰进入阳极缓冲液为止，分离凝胶，2.5%Triton-X100洗胶4次，每次30min。将胶完全浸入明胶酶孵育液（50mmol/L pH7.5Tris-HCl、10mmol/L CaCl2、200mol/LNaCl、1 μmol/LZnCl2）中，37 ℃孵育42 h，常规考马斯亮蓝染色，脱色液脱色至复染带清晰，图像分析系统测定凝胶中MMPs活性条带活性水平，应用Gel-pro analyzer分析软件测定条带平均灰度值。

1.2.5 Western blot检测 加入细胞裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，加样行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白从SDS-PAGE胶转膜至PVDF膜，利用5%脱脂奶粉封闭，然后分别加入兔抗鼠NF-κB磷酸化 P65 一抗（1∶200）、β-actin 一抗（1∶200），在37℃下作用2 h；用TBST漂洗3次，每次10min后与山羊抗兔 IgG 抗体（1∶2 000）反应，37℃作用 2 h；然后用TBST漂洗，10min/次，洗涤3次；在暗室避光X光胶片曝光，进行显影、定影、拍照。

1.3 统计学处理 实验数据以均数±标准差 （x±s）表示，采用SPSS 17.0软件做统计分析，两独立样本比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-23对B16细胞增殖能力的影响 MTT法检测结果显示，10 ng/mL IL-23作用于B16细胞24、48、72和96 h时，实验组与对照组相比，细胞活力均无显著变化，IL-23对细胞的增殖无影响，差异无统计学意义（P>0.05）（图 1）。

图1 IL-23对B16细胞增殖能力的影响Fig 1 Theeffectof IL-23 on proliferation ability of B16 cells

2.2 IL-23对B16细胞侵袭能力的影响 Transwell侵袭实验显示，10 ng/mL IL-23作用于B16细胞24 h后，与对照组相比，穿过基底膜的数目明显增多，差异有统计学意义（P<0.01）（表 1）。

表1 IL-23对B16细胞侵袭能力的影响（x±s）Tab1 Effectof IL-23 on invision ability of B16 cells（x±s）

2.3 IL-23对B16细胞MMP-2和MMP-9表达活性的影响 与对照组相比，10 ng/mL IL-23作用于B16细胞48 h后，可明显增强肿瘤细胞MMP-9活性，差异有统计学意义（P<0.01），MMP-2活性未见显著变化（P>0.05）（图 2）。

2.4 IL-23对B16细胞磷酸化NF-κB P65表达水平的影响 Western blot结果与对照组相比，IL-23处理组肿瘤细胞磷酸化P65蛋白表达水平显著升高（P<0.01），见图 3。

图2 IL-23对B16细胞MMP-9和MMP-2表达活性的影响Fig 2 Effectsof IL-23 on MMP-9 and MMP-2 expression activitiesof B16 cells

图3 IL-23处理组肿瘤细胞磷酸化P65蛋白的表达Fig 3 The expression of phosphorylated P65 in IL-23 treated B16 cells

3 讨论

慢性炎症在多种肿瘤的启动、进展及转移潜能中起着致病因子作用，炎症性细胞因子的异常表达,可以在体内募集单核巨噬细胞、中性粒细胞等到达肿瘤临近的部位，形成有利于肿瘤生长和侵袭的微环境，诱导肿瘤血管生成促进肿瘤发展进程。IL-23是近年来发现的一种同时参与慢性炎症形成和肿瘤发生的细胞因子，研究表明IL-23可促进局部环境中炎症介质的释放，抑制机体特异性免疫监视，促进黑色素瘤的发生与生长[3]；IL-23可激活Stat3信号通路，在肺癌细胞的增殖过程中发挥重要作用，并呈现其浓度依赖性[4]；IL-23也可在肝癌的发展过程中激活NF-κB信号通路加速其转移和侵袭[5]。因此针对IL-23与肿瘤细胞关系的研究对肿瘤的防治、免疫应答及调节都有重要意义。

Langowski[3]发现IL-23p19缺失的小鼠能够抵抗肿瘤发生，同时阻断IL-23信号通路也能抑制肿瘤生长。本文前期建立荷瘤小鼠-慢性炎症复合模型[6]研究中，进一步证实了IL-23对肿瘤的生长具有调节作用。最近研究表明低浓度外源性IL-23可直接促进肺癌肿瘤细胞的增殖，并参与肿瘤微环境的形成；高浓度IL-23则抑制肿瘤细胞增殖[4]。而本实验体外IL-23刺激B16细胞，肿瘤细胞增殖活性却未见明显提升，提示IL-23在不同肿瘤疾病中作用机制可能存在差异，不同IL-23浓度下肿瘤细胞的增殖效应也不尽相同。综合前期体内模型结果[6]，实验组血清检测IL-23表达升高的同时，移植瘤微血管密度（MVD）等指标显著增加，本文推测在黑色素瘤发生发展的过程中，IL-23可能通过诱导黑色素瘤细胞或基质细胞分泌MMPs、VEGF等介质，促进肿瘤血管生成进而促进肿瘤生长。

IL-23促进肿瘤微环境中Th0细胞分化为Th17细胞，Th17细胞产生IL-17A，IL-17A可以通过NF-κB上调基质金属蛋白酶的表达来促进肝癌细胞的侵袭和迁移[7]，但IL-23对肿瘤的侵袭是否有直接的作用少见报道。本文侵袭实验结果显示，IL-23处理后B16细胞穿膜细胞数明显增多，上述增殖实验提示穿膜数的增加并非由增殖引起，说明IL-23促进了B16细胞的体外侵袭。MMPs是一类与肿瘤侵袭相关的锌依赖性肽链内切酶家族，其相关的信号传导通路参与了肿瘤细胞的生长、肿瘤侵袭及肿瘤血管的形成[8]，目前发现的MMPs有23种，MMP-2、MMP-9等与肿瘤的侵袭和迁移相关，本文明胶酶谱分析IL-23处理B16细胞的MMP-9活性明显增强，说明IL-23可通过上调MMP-9的活性促进B16细胞的侵袭。Western blot分析显示IL-23促进了磷酸化P65的表达，从而激活NF-κB信号通路，说明NF-κB是MMP-9表达的关键转录因子，印证了NF-κB通路是炎症与肿瘤相联系的关键点[9]，NF-κB信号通路的活化参与了恶性肿瘤发生发展的多个环节[10]。

综上所述，IL-23对黑色素瘤B16细胞的增殖无明显的刺激作用，可通过提高MMP-9的活性而增强细胞的体外侵袭能力，这一促进作用与肿瘤细胞NF-κB信号通路的上调有关。本文研究IL-23在慢性炎症与肿瘤进展中的调节作用，并为以IL-23作为新的生物治疗靶点应用于临床提供了一定的实验依据。

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