野木瓜黄酮乙醇提取工艺的响应面法优化

崔霖芸

摘要：为确定野木瓜（Stauntonia chinensis）黄酮乙醇提取的最优工艺，采用乙醇溶液浸提野木瓜粉，通过紫外分光光度法确定浸提液中黄酮含量，并在单因素试验基础上，应用Box-Behnken试验设计和响应面分析法，考察了乙醇浓度、料液比、浸提温度和浸提时间4个因素对野木瓜黄酮提取量的影响。结果表明，野木瓜黄酮乙醇提取的最佳工艺条件为：乙醇浓度83.07%、料液比（g/mL）1∶31.88、提取温度69.81 ℃、提取时间1.97 h，从野木瓜粉中提取黄酮的理论值为33.15 mg/g，提取率为3.32%。试验结果表明采用响应面法优化的野木瓜黄酮乙醇提取工艺条件来提高野木瓜黄酮提取率的方法可行。

关键词：野木瓜（Stauntonia chinensis）；黄酮；乙醇提取；响应面法

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4130-06

Optimizing Ethanol Extraction of Flavones from Stauntonia chinensis with

Response Surface Methodology

CUI Lin-yun

（Foundational Courses Department of Zunyi Medical and Pharmaceutical College， Zunyi 563002， Guizhou， China）

Abstract： To optimize the ethanol extraction of flavones from Stauntonia chinensis， the effects of four factors including ethanol concentration， ratio of solvent to material， extraction temperature and extraction time were investigated with response surface method based on single factor experiment and Box-Behnken design. The flavones in extraction solutions were detected with UV spectrophotometry. The results showed that the optimal extraction conditions were extracting 1.97 h under 69.81 ℃ with ethanol concentration of 83.07%，and solvent-to-material ratio of 1∶31.88（mg/L）. The predicted yield of flavones from Stauntonia chinensis was 33.15 mg/g and the extraction rate of flavones was 3.32%. It is indicated that extracting flavones from Stauntonia chinensis with ethanol is reliable.

Key words：Stauntonia chinensis； flavones； ethanol extraction； response surface methodology （RSM）

野木瓜（Stauntonia chinensis）是木通科（ Lardizabalaceae）野木瓜属植物。贵州省正安县于1996年 被国务院发展研究中心等单位命名为“中国野木瓜之乡”，其盛产的野木瓜以果大、皮薄、肉细、气香、味甘酸等特点著称[1]。中医典籍记载其茎叶微苦，其果味甘、平，归心、肾经[2]，具有舒筋活络、解渴生津、平肝和胃、祛风止痛等功效。现代研究表明，野木瓜中含有丰富的皂苷，主要包括去甲五环三萜皂苷类化合物和木脂素苷类化合物，还含有黄酮苷类化合物、酚性成分、糖类化合物[3]，此外，野木瓜果实中含有丰富的有机酸、果胶、胡萝卜素、黄酮类、氨基酸、多种维生素和多种矿物质等[4]。近年来对野木瓜的研究主要集中在野木瓜的化学成分[5-8]和皂苷、多糖、果酸等的测定、提取和分离研究[9-11]， 对野木瓜黄酮的研究则仅见唐维媛等[12]对野木瓜总黄酮量的测定。本试验主要应用响应面法来优化野木瓜黄酮的提取工艺， 旨在为野木瓜的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

野木瓜，购自贵州省正安县。芦丁（BR，国药集团化学试剂有限公司），石油醚、无水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH均为分析纯。

752N型紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司），SHZ-DⅢ型循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），BSA223型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司），HH-2型数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理 将野木瓜鲜果洗净→去子囊切成2～5 mm薄片→50 ℃烘干→粉碎后过40目筛→石油醚脱色回流至石油醚无色→抽滤，滤渣风干。

1.2.2 芦丁标准曲线的制定 准确称量25 mg芦丁样品，溶于95%乙醇中并定容至50 mL，制成0.5 mg/mL芦丁标准溶液。分别取该标准溶液0、1、2、3、4、6、8 mL置于50 mL容量瓶中，分别加入30%乙醇溶液20、19、18、17、16、14、12 mL摇匀，再分别加入1 mL 5% NaNO2摇匀放置6 min，再加入1 mL 10%Al（NO3）3摇匀放置6 min，然后加入7 mL 4% NaOH并用30%乙醇溶液定容摇匀放置11 min后在510 nm波长处测定其吸光度，以芦丁标准溶液浓度（C）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：C=0.014+9.817A，R2=0.999。

1.2.3 野木瓜提取液中黄酮含量的测定 取经处理后的野木瓜粉1 g，按试验条件浸提后迅速抽滤，并将滤液定容到100 mL，取该液10 mL置于50 mL容量瓶中，按“1.2.2”的方法加入各试剂后定容，在510 nm处测定吸光度（A），根据标准曲线求得测试液中黄酮含量，并计算黄酮提取率（黄酮提取率=黄酮质量/野木瓜质量×100%）。

1.2.4 单因素试验

1）乙醇浓度对野木瓜黄酮提取量的影响：分别取预处理后的野木瓜粉1 g放入250 mL圆底烧瓶中，分别加入30%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液40 mL，在70 ℃水浴中回流浸提2 h，然后迅速抽滤，滤液用30%乙醇定容到100 mL，取该液10 mL放入50 mL容量瓶中，按“1.2.2”的方法在510 nm处测其吸光度。

2）料液比对野木瓜黄酮提取量的影响：分别取预处理后的野木瓜粉1 g放入250 mL圆底烧瓶中，按料液比（g/mL，下同）1∶10、1∶20、1∶30、 1∶40、 1∶50、

1∶60分别加入70%乙醇溶液，在70 ℃水浴中回流浸提2 h，然后迅速抽滤，滤液用30%乙醇定容到100 mL。取该液10 mL放入50 mL容量瓶中，按“1.2.2”的方法在510 nm处测其吸光度。

3）提取温度对野木瓜黄酮提取量的影响：分别取预处理后的野木瓜粉1 g放入250 mL圆底烧瓶中，加入70%的乙醇溶液40 mL，分别在50、60、70、80、90 ℃水浴中回流浸提2 h，然后迅速抽滤，滤液用30%乙醇定容到100 mL，取该液10 mL放入50 mL容量瓶中，按“1.2.2”的方法在510 nm处测其吸光度。

4）提取时间对野木瓜黄酮提取量的影响：分别取预处理后的野木瓜粉1 g放入250 mL圆底烧瓶中，加入70%的乙醇溶液40 mL，在70 ℃水浴中分别回流浸提1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，然后迅速抽滤，滤液用30%乙醇定容到100 mL，取该液10 mL放入50 mL容量瓶中，按“1.2.2”的方法在510 nm处测其吸光度。

1.2.5 响应面优化的Box-Behnken试验设计 应用Design-Expert 8.0.7.1 Trial软件，结合单因素试验结果，选取乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4个主要因素，确定4因素3水平的Box-Behnken试验优化设计，其因素及水平见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1乙醇浓度对野木瓜黄酮提取量的影响 由图1可见，随着乙醇浓度的增加，野木瓜黄酮提取量不断增加，在乙醇浓度为80%时达到最高值，随后降低。其原因可能是乙醇浓度较低时，水的含量相对较高使黄酮提取率较低；当乙醇浓度过高时，一些脂溶性物质的溶出量增大使黄酮类物质的溶解度降低，从而导致黄酮提取量降低[13]。而逯家辉等[14]根据相似相溶原理，认为极性相似可达到最大溶出度，当总黄酮得率达到峰值时，溶剂与溶质极性相似。因此确定乙醇浓度80%为最佳浓度。

2.1.2 料液比对野木瓜黄酮提取量的影响 由图2可见，随着溶剂的增加，野木瓜黄酮提取量不断增加，但在1∶40后变化平缓，从经济的角度考虑，确定其料液比为1∶40。

2.1.3 提取温度对野木瓜黄酮提取量的影响 由图3可知，随着提取温度的增加，野木瓜黄酮提取量显著增加，在70 ℃时达到最大，随后略有下降。提取温度的升高可加速黄酮类物质的渗透、扩散及溶解的速度，有利于黄酮的溶出，但过高的温度容易使黄酮类化合物氧化[13，15]，引起黄酮物质结构发生变化，破坏黄酮物质[16，17]，从而使黄酮提取率下降。因此确定70 ℃为最佳提取温度。

2.1.4 提取时间对野木瓜黄酮提取量的影响 由图4可知，随提取时间增加，野木瓜黄酮提取量增加，提取2.0 h时达到最高值，随后略有下降。这可能是因为提取一定时间后，野木瓜中的黄酮类化合物已基本提出，提取时间过长则使黄酮类物质结构被破坏[13]。因此，提取时间以2.0 h为宜。

2.2 野木瓜提取黄酮的响应面优化结果

根据单因素试验结果，应用Design-Expert 8.0.7.1 Trial软件，确定4因素3水平的Box-Behnken试验方案及结果见表2。

用Design-Expert 8.0.7.1 Trial软件对表2结果进行统计分析，得二次回归方程（此处为避免与因素A混淆，吸光度用字母Z代替）：

Z=0.66+0.023A-0.022B+0.023C-0.013D-0.015AB+0.019AC+0.011AD+0.035BC-0.010BD+0.0065CD-0.085A2-0.015B2-0.047C2-0.025D2

方差分析结果见表3。由表3可以看出，回归模型高度显著（P<0.000 1），失拟项不显著（P=0.279 9>0.05），R2=0.980 0，说明响应值变化的98.00%可由所选因素的变动来解释。Adj R2（修正的拟合优度）=0.960 0，且模型除AD、BD、CD交互项的系数不显著外均达到显著水平，表明此模型预测值对试验实测值拟合较好。

从F值可知，各因素对野木瓜中黄酮提取量的影响依次为乙醇浓度（A）>提取温度（C）>料液比（B）>提取时间（D）。其中乙醇浓度、提取温度和料液比对野木瓜黄酮提取量的影响较大，提取时间的影响相对较小，这和前面的单因素试验结果一致。

图5至图10是通过Design-Expert 8.0.7.1 Trial软件根据表2的试验结果和响应方程所绘制的响应曲面图和等高线图，直观地描述了两因素间的交互作用。等高线的形状反映交互效应的强弱大小，图形为圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则表示两因素交互作用显著[18]。除图10（提取温度和提取时间）中的图形接近圆形外，其余均呈椭圆形，说明除提取温度和提取时间的交互作用不显著外，其他各因素的交互作用均较明显。

通过Design-Expert 8.0.7.1 Trial软件分析得到乙醇溶液提取野木瓜黄酮的最优工艺条件为乙醇浓度83.07%、料液比1∶31.88、提取温度69.81 ℃、提取时间1.97 h，在此最优条件下，野木瓜中的黄酮提取量理论值为33.15 mg/g，提取率为3.32%。结合实际试验条件，最终确定其最优条件为乙醇浓度83%、料液比1∶32、提取温度70 ℃、提取时间2.0 h。经5次平行试验，测得野木瓜黄酮的实际提取量为32.96 mg/g，提取率为3.30%，与理论值相差不大，二者基本吻合，说明该模型拟合好，用该响应面优化条件来提高野木瓜黄酮提取率的方法可行。

3 结论

本试验采用响应面法对野木瓜黄酮乙醇提取工艺条件进行优化，结果表明该方法合理可行。确定野木瓜黄酮乙醇提取的最佳工艺条件为乙醇浓度83.07%、料液比1∶31.88、提取温度69.81 ℃、提取时间1.97 h，在此最优条件下，从野木瓜粉中提取黄酮的理论值为33.15 mg/g，提取率为3.32%。实际测得黄酮含量为32.96 mg/g，提取率为3.30%，与理论值基本吻合。各因素对野木瓜黄酮提取量的影响依次为乙醇浓度>提取温度>料液比>提取时间。采用响应面法优化的野木瓜黄酮乙醇提取工艺条件对野木瓜的综合利用具有理论指导意义。

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通过Design-Expert 8.0.7.1 Trial软件分析得到乙醇溶液提取野木瓜黄酮的最优工艺条件为乙醇浓度83.07%、料液比1∶31.88、提取温度69.81 ℃、提取时间1.97 h，在此最优条件下，野木瓜中的黄酮提取量理论值为33.15 mg/g，提取率为3.32%。结合实际试验条件，最终确定其最优条件为乙醇浓度83%、料液比1∶32、提取温度70 ℃、提取时间2.0 h。经5次平行试验，测得野木瓜黄酮的实际提取量为32.96 mg/g，提取率为3.30%，与理论值相差不大，二者基本吻合，说明该模型拟合好，用该响应面优化条件来提高野木瓜黄酮提取率的方法可行。

3 结论

本试验采用响应面法对野木瓜黄酮乙醇提取工艺条件进行优化，结果表明该方法合理可行。确定野木瓜黄酮乙醇提取的最佳工艺条件为乙醇浓度83.07%、料液比1∶31.88、提取温度69.81 ℃、提取时间1.97 h，在此最优条件下，从野木瓜粉中提取黄酮的理论值为33.15 mg/g，提取率为3.32%。实际测得黄酮含量为32.96 mg/g，提取率为3.30%，与理论值基本吻合。各因素对野木瓜黄酮提取量的影响依次为乙醇浓度>提取温度>料液比>提取时间。采用响应面法优化的野木瓜黄酮乙醇提取工艺条件对野木瓜的综合利用具有理论指导意义。

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3 结论

本试验采用响应面法对野木瓜黄酮乙醇提取工艺条件进行优化，结果表明该方法合理可行。确定野木瓜黄酮乙醇提取的最佳工艺条件为乙醇浓度83.07%、料液比1∶31.88、提取温度69.81 ℃、提取时间1.97 h，在此最优条件下，从野木瓜粉中提取黄酮的理论值为33.15 mg/g，提取率为3.32%。实际测得黄酮含量为32.96 mg/g，提取率为3.30%，与理论值基本吻合。各因素对野木瓜黄酮提取量的影响依次为乙醇浓度>提取温度>料液比>提取时间。采用响应面法优化的野木瓜黄酮乙醇提取工艺条件对野木瓜的综合利用具有理论指导意义。

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