金银花尺蠖幼虫血细胞形态观察

向玉勇+朱园美+殷培峰

摘要：运用Wrights-Giemsas染色和光学显微镜对金银花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）幼虫血细胞的形态进行观察，发现金银花尺蠖幼虫血淋巴中有原血胞、浆血胞、粒血胞、珠血胞、类绛血胞和囊血胞6 种类型的血细胞。

关键词：金银花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）；血细胞；形态观察

中图分类号：Q969.93 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4052-04

Morphological Observation on Larva Hemocytes of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.

XIANG Yu-yong， ZHU Yuan-mei， YIN Pei-feng

（School of Biology and Food Engineering， Chuzhou University， Chuzhou 239012，Anhui，China）

Abstract： The larva hemocytes morphous of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu. was observed with Wright's-Giemsa's stain method and light microscopy technology. The results showed that there were 6 types of hemocytes in larva hemolymph of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.including prohemocytes， plasmatocytes， granulocytes， spherulocytes， oenocytoids and cystocytes.

Key words： Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.； hemocytes；morphous observation

昆虫是动物界中最大的类群，在长期进化的过程中形成了一套复杂的免疫系统，对入侵的病原体具有识别和清除能力，主要包括体液免疫和细胞免疫应答[1，2]。血细胞是昆虫细胞免疫的主要执行者，在抵抗病原体入侵的免疫应答过程中发挥着重要作用。昆虫种类不同，参与细胞免疫的血细胞种类不同[3]，血细胞的某些生理机能变化常常表现为细胞形态和组成的变化。因此，研究昆虫血细胞形态分类对深入揭示其细胞免疫功能具有重要推动作用。自1669年Swammerdam首次发现昆虫的“白”血细胞以来[4，5]，人们对昆虫血细胞的研究已有 340多年的历史，涉及蚊（Culicidae）、蝇（Muscidae）、 蚋（Simuliidae）、蜚蠊（Blattaria）、蚕（Bombyx mori）、粘虫[Mythimna separata（Walker）]等100多种昆虫[6，7]。由于昆虫种类繁多，其血细胞形态各异，甚至同一种昆虫不同虫态、虫龄在不同生态、生理条件下的血细胞形态也存在显著差异。昆虫血细胞的分类比较复杂，存在的分歧很多[8]。因此，应对更多种类的昆虫血细胞形态进行研究，以丰富其形态分类。

金银花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）是近年来新发现的为害金银花的食叶害虫之一，该虫为鳞翅目尺蛾科昆虫，别名拱腰虫，在安徽省1年发生3代[9]，常将叶片咬成缺刻或孔洞，危害严重的地块金银花叶片被全部吃光，仅剩叶脉和叶柄，常造成金银花大面积减产，甚至成片死亡，给金银花生产带来严重损失。目前，国内对金银花尺蠖的研究主要集中在生物学特性及防治方面[9-13]，对其血细胞的形态学研究尚未见报道。本研究对金银花尺蠖幼虫血细胞形态进行观察，以期为金银花尺蠖幼虫血细胞分类和细胞免疫研究提供试验依据， 同时也为金银花尺蠖的防治提供新途径。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

从滁州市郊三界镇野生金银花上采集金银花尺蠖幼虫，带回实验室于人工气候箱（RXZ-288A型，宁波江南仪器制造厂）中用新鲜的金银花叶片饲养多代，选取老熟幼虫备用。人工气候箱光周期（L∶D）为14 h∶10 h，温度为（25±1） ℃，相对湿度为（70±7）%。

1.2 试剂

Wrights染料（Sigma公司）、Giemsa染料（德国AppliChem公司）、磷酸二氢钾（广东西陇化工股份有限公司）、磷酸氢二钠（广东西陇化工股份有限公司）、甘油（无锡市晶科化工有限公司）、甲醇（上海凌峰化学试剂有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 染液配制 Wrights染液：称取Wrights染料粉末0.1 g放在研钵内，加入60 mL甲醇充分研磨，使染料全部溶解，然后把溶解的染料倒入干净的棕色玻璃瓶中，在室温条件下密封保存，7 d后即可使用。

Giemsa染液：称取Giemsa粉0.75 g放入研钵中， 加入50 mL甘油， 研磨后置于58 ℃水浴中搅拌加热90 min，溶入50 mL甲醇中，摇匀后置于37 ℃恒温箱内保温8～12 h，过滤后置于棕色瓶中密封保存，即为Giemsa原液，12 h后即可使用。临用时，取1 mL Giemsa原液与10 mL PBS（pH 6.8）混合。

1.3.2 配制1/15 mol/L磷酸缓冲液（PBS）

pH 6.8：称取磷酸氢二钠0.47 g，磷酸二氢钾0.46 g，加入少量去离子水溶解，再定容至1 000 mL。

pH 7.2：称取磷酸氢二钠0.68 g，磷酸二氢钾0.25 g，加入少量去离子水溶解，再定容至1 000 mL。

1.3.3 涂片与观察 取金银花尺蠖老熟幼虫10头，用无菌水清洗后擦干，用解剖针将其腹部刺破， 用移液器取少量血液，滴在载玻片上涂成血膜，先用Wrights染液将血膜面充分覆盖，稍等片刻再加Giemsa染液2～3滴，1 min后再缓慢地一滴一滴加磷酸盐缓冲液（pH 7.2），直至膜面上染色液形成表面张力而终止加入。染色30 min后用自来水缓缓冲洗，凉干封片，在光学显微镜（BM2100型，南京江南永新光学有限公司）下观察。

2 结果与分析

按照Jones[14]的分类标准，通过光学显微镜观察，发现金银花尺蠖老熟幼虫的血细胞包括原血胞、浆血胞、粒血胞、珠血胞、类绛血胞和囊血胞6 种类型。这些血细胞在不同个体间形态与数量略有变化。

2.1 原血胞（Prohemocytes，PR）

原血胞也称为原始血细胞，是数量较少的小型细胞，呈圆形或卵圆形，轮廓清晰，表面无突起，较光滑。细胞核为单核，紫红色或红色，位于细胞中央，比例很大，几乎充满整个细胞。细胞质比较均匀，仅为薄薄的一层环绕在核周围，无明显颗粒状物质（图1A）。一般认为此类细胞为原始型，由造血器官或造血组织生成，可分化形成其他类型的血细胞，故名原血胞。

2.2 浆血胞（Plasmatocytes，PL）

浆血胞也称为原生质细胞，有球形、卵形、纺锤形、叶形及不规则形等多种形态，且大小不一。细胞核大，单核，位于细胞中央，约占细胞体积的一半。细胞质均一，无颗粒内含物（图1 B、图1C）。

2.3 粒血胞（Granulocytes，GR）

粒血胞是金银花尺蠖幼虫血淋巴中普遍存在的一种血细胞，在光学显微镜下易于辨识，呈圆形、卵圆形或不规则形状。细胞核多为圆形和卵圆形，位于细胞中央，约占细胞体积的一半。细胞质内含较大的异质性溶酶体颗粒，据此可与浆血胞相区分（图1D）。

2.4 珠血胞（Sphrulocytes，SP）

珠血胞多为大中型细胞，呈圆形，细胞内有大小不同、数目不等的珠形内含物围成一圈，细胞核难以观察到（图1E）。

2.5 类绛血胞（Oenocytoids，OE）

类绛血胞是金银花尺蠖幼虫血淋巴中最大型的血细胞，细胞外形不规则，细胞核较小，呈圆形，位于细胞的一侧， 有的有2 个核，细胞质浓厚而均匀（图1F）。

2.6 囊血胞（Cystocytes，CY）

囊血胞多为中型细胞，呈圆形或椭圆形，细胞边缘较光滑，细胞质内具有大小不一的带有折光性的颗粒或块状物（图1 G）。

3 讨论

昆虫可产生多种类型的血细胞，通常可用形态、组织化学及功能特征来鉴别。血细胞的形态观察是研究昆虫细胞免疫反应的基础，国内的昆虫学工作者对多种昆虫血细胞的形态进行观察，发现了在不同种类的昆虫中存在不同类型的血细胞，如刘玉滨等[15]利用扫描电镜技术在华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita Fald.）3龄幼虫血淋巴内识别出5种类型的血细胞，分别是原血胞、浆血胞、颗粒血胞、珠血胞和凝血胞；迟淑萍等[16]利用瑞氏染色法在德国小蠊（Blattella germanica）血淋巴中发现原血胞、浆血胞、颗粒血胞、珠血胞和类绛血胞5种类型的血细胞；王世贵等[17]利用姬姆萨染色和光学显微镜在红褐斑腿蝗（Catantops pinguis）血淋巴中发现了原血胞、浆血胞、粒血胞、珠血胞和囊血胞5种类型的血细胞；贾雷坡等[18]通过Wrights染色和光学显微镜对不同地区东亚飞蝗[Locusta migratoria manilensis（Meyen）]的血细胞进行观察，发现东亚飞蝗的血细胞包括原血胞、浆血胞、粒血胞及类绛血胞4种类型；晏容等[19]应用姬姆萨染色结合相差显微镜及荧光染色方法在家蝇（Musca domestica）3龄幼虫血淋巴中发现了原血胞、浆血胞、粒血胞、珠血胞及类绛血胞5种类型的血细胞；魏丽芳等[20]应用荧光显微镜和扫描电镜观察识别出白蜡绵粉蚧（Phenacoccus fraxinus）血淋巴中有原血胞、浆血胞、粒血胞、类绛色血胞及囊血胞5种类型的血细胞。大量的研究表明，在鳞翅目昆虫中有原血胞、浆血胞、粒血胞、珠血胞及类绛色血胞5种类型的血细胞[21]，笔者对鳞翅目昆虫金银花尺蠖幼虫血细胞形态进行观察，发现金银花尺蠖幼虫体内存在原血胞、浆血胞、粒血胞、珠血胞、类绛色血胞及囊血胞6种类型的血细胞，这一结果进一步说明了不同种类的昆虫在不同的生长期血细胞种类均有差异。还需进一步对金银花尺蠖其他虫态和不同发育龄期的血细胞形态进行观察比较，从而更加准确地鉴定血细胞的类型。

血细胞在昆虫免疫中具有重要地位，通过各种血细胞与体液因子的协同作用，对侵入体内的病原体及异物发生明显的免疫防御反应。不同的血细胞具有不同的功能，原血胞无吞噬功能，但具有活跃的分裂增殖能力，并可转化为浆血胞，其主要功能为分裂补充血细胞，多数学者认为此类细胞为原始型，由造血器官或造血组织生成，其他各类血细胞多由其衍生；浆血胞的主要功能是吞噬异物，同时也参与包被和成瘤作用，是主要的防卫血细胞，并可转化为粒血胞；粒血胞的主要功能是贮存代谢，此外还参与防卫；珠血胞具有贮存和分泌作用，无吞噬功能；类绛血胞无吞噬功能，主要参与物质代谢和分泌；囊血胞可能与昆虫血淋巴的凝集和免疫有关[22，23]。

由于昆虫的种类不同，对外来入侵物的细胞免疫反应也不尽相同[8]，因此，还需深入研究金银花尺蠖幼虫的血细胞在免疫应答中所起的作用，探讨其血细胞免疫功能和作用机制，从而为金银花尺蠖的防治提供理论指导。

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