樱桃菌根真菌分离培养条件及有效性

刘辉+王志莉+徐迎迎+杨守军

摘要：采用PDA培养基、PDA-抗生素培养基以及MMN培养基，通过切片法从一年生樱桃（Prunus pseudocerasus）根中分离菌根真菌，用打孔法分离得到纯化菌株，并对菌株的生理生化特征进行系统鉴定。结果表明，切片分离时的表面消毒条件和方法以及分离培养基的选用均直接影响菌根真菌的分离纯化结果及菌根真菌的多样性。该菌利用HgCl处理6 min，接种在改良MMN培养基中分离效果最好，该菌的最适pH 7，最适温度为25 ℃，最适P浓度KH2PO4和K2HPO4分别为0.50 g/L和1.00 g/L，最适C源为可溶性淀粉，最适N源为尿素。将该菌加入到生长基质中能将炼苗期的樱桃苗的成活率由73%提高到86%。

关键词：樱桃（Prunus pseudocerasus）；菌根真菌；分离；培养条件；有效性

中图分类号：O939.96 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4025-04

Culture Conditions and Validity of Isolated Cherry

（Prunus pseudocerasus） Mycorrhizal Fungi

LIU Hui， WANG Zhi-li， XU Ying-ying， YANG Shou-jun

（Polytechnic Institute，China Agricultural University（Yantai）， Yantai 264670， Shandong， China）

Abstract： The process of isolating micorrhizal fungi from cherry root by sectioning was evaluated and the isolated fungi were identified. The isolated fungi were cultivated in the PDA medium， PDA-antibiotic medium and MMN medium and subsequently purified by punch method. The results showed that disinfection conditions and methods of slice surface and medium selection affected directly the purification and diversity of the fungi isolated. The best isolation was on the modified MMN medium as isolated fungi were sterilized by HgCl for 6 minutes. The isolated fungi could better growth at 25 ℃， pH 7.0， KH2PO4 0.50 g/L and K2HPO4 1.00 g/L. Soluble starch and urea were the best sources of carbon and nitride. Survival rate of cherry seedlings increased from 73 % to 86% after adding the isolated fungi into substrate.

Key words： cherry（Prunus pseudocerasus）； mycorrhizal fungi； isolation；culture conditions；validity

菌根（AM）是真菌菌丝与植物的根部紧密结合形成的一种特殊结构，与植物形成菌根的真菌称为菌根真菌[1-3]。在菌根共生体中，大量延伸到土壤中的根外菌丝扩大了根系的吸收面积，并可通过菌丝从土壤中吸收水分和矿质营养元素（尤其是P和N）传递给植物；另一方面，菌根真菌可以通过根内菌丝从宿主植物体内获得其生长繁殖所需的碳水化合物和一些生长物质，从而形成一种营养上的互利共生关系[4，5]。研究发现，樱桃（Prunus pseudocerasus）根系的侵染率为56.11%[6]，但目前国内对樱桃菌根共生体系建立方面的研究较少。本研究从一年生的樱桃根系中分离菌根真菌，并对该菌进行培养鉴定，最后将该菌与炼苗期的樱桃建立共生体系，为今后相关菌剂的生产和共生体系的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植株 试验材料为一年生的樱桃幼苗和组培樱桃苗，分别由中国农业大学烟台校区试验基地及组培实验室提供。苗木均为长势良好、均匀一致的植株。

1.1.2 分离培养菌根真菌所用的培养基

1）PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖15 g，蛋白胨4 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1 g，无水CaCl2 0.02 g，ZnSO4 0.002 7 g，FeSO4 0.027 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，琼脂20 g，去离子水1000 mL。

2）PDA-抗生素培养基[7]：马铃薯200 g，葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，酒石酸铵少量，微量元素溶液3 mL（每1 000 mL微量元素混合液含有H3BO3 8.45 g，MnSO4 5.00 g，CuSO4·5H2O 0.63 g，FeSO4 6.00 g，ZnSO4 2.27 g，（NH4）2MoO4 0.27 g）。

3）MMN培养基[8]：CaCl2 0.05 g，NaCl 0.025 g， KH2PO4 0.5 g，（NH4）2HPO4 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，FeCl3（1%溶液）1.2 mL，麦芽粉3 g，葡萄糖10 g，VB1 0.1 g，牛肉膏蛋白胨15 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，pH 5.5。

1.2 方法

1.2.1 菌根真菌的分离和纯化培养 分离方法参照郭顺星等[9]的关于菌根真菌的分离方法，略作改进。取樱桃根根尖8～10 cm，清水洗净，用75%酒精处理30 s，无菌水冲洗3次，滤纸吸干。再用0.1%的HgCl溶液分别处理2、4、6、8 min，无菌水冲洗3次，滤纸吸干。用灭菌解剖刀在培养皿中将根横切成1 cm长条，将长条分别置于PDA、PDA-抗生素、MMN培养基上，每个培养皿采用五点法放五根长条，每个处理梯度5次重复。在恒温25 ℃下培养7 d，观察比较不同处理时间和培养基感染情况及菌根真菌的出菌情况，并将未感染部分转至最佳培养基进行纯化培养。

1.2.2 最适温度的测定 采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入最优培养基中，每个梯度3次重复，将培养基分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃的环境下培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.3 最适pH的测定 将最优培养基用1 mol/L HCl和1 mol/L NaCl调节pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11（pH为2、3的培养基将琼脂量提高1倍，使其凝固），采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入不同pH的培养基中，每个梯度3次重复，在恒温25 ℃培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.4 最适P浓度的测定 将最优培养基的KH2PO4和K2HPO4调节至（0.25，0.5）、（0.5，1）、（0.75，1.5）、（1，2）、（1.25，2.5） g/L，保持pH为最优值，采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入不同P浓度的培养基中，每个梯度3次重复，在恒温25 ℃培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.5 最适C源的测定 将最优培养基的C源分别利用20 g/L的葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖替代，采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入不同C源的培养基中，每个梯度3次重复，在恒温25 ℃培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.6 最适N源的测定 将最优培养基的N源分别利用15.75 g/L蛋白胨、15.75 g/L牛肉膏、2.36 g/L尿素、 4.21 g/L NH4Cl、 7.95 g/L KNO3替代（保证N含量一致），采用打孔法， 在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入不同N源的培养基中， 每个梯度3次重复，在恒温25 ℃培养4 d， 采用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.7 有效性检测 将最优培养基中的菌根放入麸皮培养基进行菌根真菌活化。培养7 d后，将麸皮培养基低温烘干后，均匀加入100棵处于炼苗期的樱桃苗的培养土中，同时取100棵长势相同的樱桃苗作对照。培养45 d后，测算成活率和根系侵染率，侵染率采用台盼蓝染色法和格线交叉法测定[10]。

1.3 数据分析

试验数据用Mirosoft Excel 2007进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 处理时间和培养基种类的影响

从图1可以看出，在处理时间一致的情况下，MMN培养基感染杂菌量显著少于PDA、PDA-抗生素培养基；同一种培养基随处理时间的延长感染杂菌量逐渐减少，其中处理时间4、6、8 min感染杂菌的减少量不显著，MMN培养基处理时间6、8 min感染杂菌量相同。从图2可以看出，在处理时间一致的情况下，MMN培养基长菌量显著高于PDA、PDA-抗生素培养基，其中当处理时间为4、6 min时长菌量较多。综合图1、图2数据发现，当MMN培养基在处理时间为6 min时，既能有效抑制杂菌的生长，又能使长菌量达到较高水平。

2.2 不同温度对菌落直径的影响

从图3可以看出，当温度为5 ℃时，菌根真菌菌落停止生长。随着温度升高，菌根真菌的菌落直径逐渐增大，当温度升高到25 ℃时，菌落直径达到最大，为原来的4.71倍。当温度继续升高时，菌落直径开始逐渐减小。数据表明，温度对菌根真菌生长影响显著。

2.3 培养基pH对菌根真菌生长的影响

由图4可以看出，当pH 2时，菌根真菌停止生长。随着pH的增大，菌根真菌的生长速度逐渐提高，当pH达到7时，菌落直径最大，为4.98 cm。当pH继续增大时，菌落直径开始缓慢减小。当pH为5～10时，菌落直径变化不明显，表明pH对菌根真菌的生长影响在一定范围内不显著。

2.4 培养基P浓度对菌根真菌生长的影响

图5表明，在不同浓度P条件下，菌落直径存在一定差异，但总体差异不大。当KH2PO4和K2HPO4分别为0.50 g/L和1.00 g/L时，菌落直径最大。

2.5 培养基C源对菌根真菌生长的影响

由图6可以看出，在不同C源条件下，菌落直径存在显著差异，其中当C源为葡萄糖时，菌落直径最小；当C源为可溶性淀粉时，菌落直径最大，比C源为葡萄糖时的菌落直径大0.43 cm。数据表明，不同C源对菌根真菌菌落直径的影响存在差异。

2.6 培养基N源对菌根真菌生长的影响

从表1可以看出，在不同N源条件下，菌落直径差异较为明显。当尿素为N源时菌落直径达到最大，当氯化铵为N源时，菌落直径最小。数据表明，不同的N源对菌落直径产生不同的影响。

2.7 菌根共生体系建立

通过对樱桃苗根系侵染率及植株成活率进行检测，结果表明，施加菌根真菌的根系侵染率为27.1%，对照组为0；施加菌根真菌的植株成活率为86%，高于对照组的73%。分析结果可知，该菌根真菌经过分离培养仍具有一定的有效性，可以显著提高植株的成活率。

3 讨论

通过用PDA培养基、PDA-抗生素培养基、MMN培养基分离该菌发现，三者对该菌的分离具有明显差异。其中，MMN培养基可以有效减少杂菌的感染量，而PDA培养基和PDA-抗生素培养基杂菌感染量均较高，并且MMN培养基能够明显促进该菌的生长，具体作用机理有待进一步研究。HgCl处理时间对根系感染具有明显的抑制作用，其在6 min内能明显减少杂菌感染量，当超过6 min时，这一作用不太明显。与此同时，处理时间也影响该菌的生长，在处理时间较短时，由于杂菌较多会直接影响到该菌的生长，随着处理时间的延长，杂菌感染量减少，促进该菌生长，但过长的处理时间可能会杀死根系内部的真菌孢子，导致该菌生长减缓。

温度是影响菌根真菌生长的重要因素。一般而言，菌根真菌对温度反应灵敏，20～28 ℃条件下是多数菌根真菌的最适生长温度，而最高耐受温度为35 ℃[11]。该菌的最适温度是25 ℃，但是在35 ℃时仍能生长。通常情况下，菌根真菌喜酸性，在酸性土壤中中接种可以形成菌根[12]。但本研究表明，该菌的最适pH 7，而且在pH 5～10时，pH对该菌生长的影响不明显，这在一定程度上说明菌根真菌的培养与菌根共生体系建立所需要的酸碱环境不一致。P浓度对菌根的形成具有显著的影响，试验证明，当每千克土壤的磷酸二氢钙含量超过6 g时，菌根不能形成[13]。本研究表明，在上述范围内，P浓度对该菌的生长影响不明显。大多数研究表明，不同种类的菌根真菌对C源的利用较为广泛，既可以利用单糖、低聚糖等速效C源，也可以利用淀粉等长效C源。本研究发现，该菌在以可溶性淀粉为C源的培养基中生长最快，其次是蔗糖。本研究发现，该菌对N源的种类要求不高，但以尿素最佳。

本研究通过对该菌有效性进行检测发现，施加该菌可以提高炼苗期樱桃苗的成活率，因此该菌可以制成菌剂应用于炼苗期樱桃苗，对于其他植物的影响有待进一步研究。同时，该菌的侵染率并未达到对樱桃植株侵染率的最大值，相关原因有待研究。

参考文献：

[1] 郝文英.80年代以来VA菌根研究进展[J].土壤学进展，1991， 19（2）：1-8.

[2] RUEHLE J L， DONALD H M. Fiber ， food， fuel， and fungal symbionts[J]. Nature， 1979， 206 （26）： 419-422.

[3] PAULA M A， URQUIAGA S， SIJQUEIRA J O. Sygergistic effects of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi and diazotrophicus bacteria on nutrition and growth of sweet potato （Ipomoea batatas）[J] .Biology and Fertility of Soils，1992，14： 61-66.

[4] 赵之伟.菌根真菌在陆地生态系统中的作用[J].生物多样性， 1999，7（3）：240-244.

[5] POWELL C L， BAGYARAJ D J. VA Mycorrhiza[M]. Florida： CRC Press， Inc，1984.

[6] 刘润进，薛炳烨，黄 镇，等.山东果树泡囊-丛枝（VA）菌根调查[J]. 山东农业大学学报，1987，18（4）：25-31.

[7] 陶 诗，刘一令，黄小香，等.春兰菌根真菌的分离及培养条件特征研究[J]. 北方园艺， 2010（16）： 108-111.

[8] 贾东贝，杨 涛，肇 莹，等. 2株越橘菌根培养条件的研究[J]. 江苏农业科学，2011，39（2）：466-468.

[9] 郭顺星，曹文芩，高微微，等.铁皮石斛及金钗石斛菌根真菌的分离及其生物活性测定[J].中国中药杂志，2000，25（6）：338-341.

[10] 盛萍萍，刘润进，李 敏，等. 丛枝菌根观察与侵染率测定方法的比较[J].菌物学报，2011，30（4）：519-525.

[11] 蒋盛岩，张 平，胡劲松，等. 外生菌根菌白毒伞（Amanita verna）菌丝体纯培养条件[J].湖南师范大学自然科学学报， 2002，25（1）：75-77.

[12] 於 虹.蓝浆果栽培与采后处理技术[M].北京：金盾出版社， 2003.

[13] MOSSE B. Plant growth responses to vesicular-arbuscular mycorrhiza. IV. In soil given additional phosphate[J]. New Phytol，1973，72：127-136.

2.7 菌根共生体系建立

通过对樱桃苗根系侵染率及植株成活率进行检测，结果表明，施加菌根真菌的根系侵染率为27.1%，对照组为0；施加菌根真菌的植株成活率为86%，高于对照组的73%。分析结果可知，该菌根真菌经过分离培养仍具有一定的有效性，可以显著提高植株的成活率。

3 讨论

通过用PDA培养基、PDA-抗生素培养基、MMN培养基分离该菌发现，三者对该菌的分离具有明显差异。其中，MMN培养基可以有效减少杂菌的感染量，而PDA培养基和PDA-抗生素培养基杂菌感染量均较高，并且MMN培养基能够明显促进该菌的生长，具体作用机理有待进一步研究。HgCl处理时间对根系感染具有明显的抑制作用，其在6 min内能明显减少杂菌感染量，当超过6 min时，这一作用不太明显。与此同时，处理时间也影响该菌的生长，在处理时间较短时，由于杂菌较多会直接影响到该菌的生长，随着处理时间的延长，杂菌感染量减少，促进该菌生长，但过长的处理时间可能会杀死根系内部的真菌孢子，导致该菌生长减缓。

温度是影响菌根真菌生长的重要因素。一般而言，菌根真菌对温度反应灵敏，20～28 ℃条件下是多数菌根真菌的最适生长温度，而最高耐受温度为35 ℃[11]。该菌的最适温度是25 ℃，但是在35 ℃时仍能生长。通常情况下，菌根真菌喜酸性，在酸性土壤中中接种可以形成菌根[12]。但本研究表明，该菌的最适pH 7，而且在pH 5～10时，pH对该菌生长的影响不明显，这在一定程度上说明菌根真菌的培养与菌根共生体系建立所需要的酸碱环境不一致。P浓度对菌根的形成具有显著的影响，试验证明，当每千克土壤的磷酸二氢钙含量超过6 g时，菌根不能形成[13]。本研究表明，在上述范围内，P浓度对该菌的生长影响不明显。大多数研究表明，不同种类的菌根真菌对C源的利用较为广泛，既可以利用单糖、低聚糖等速效C源，也可以利用淀粉等长效C源。本研究发现，该菌在以可溶性淀粉为C源的培养基中生长最快，其次是蔗糖。本研究发现，该菌对N源的种类要求不高，但以尿素最佳。

本研究通过对该菌有效性进行检测发现，施加该菌可以提高炼苗期樱桃苗的成活率，因此该菌可以制成菌剂应用于炼苗期樱桃苗，对于其他植物的影响有待进一步研究。同时，该菌的侵染率并未达到对樱桃植株侵染率的最大值，相关原因有待研究。

参考文献：

[1] 郝文英.80年代以来VA菌根研究进展[J].土壤学进展，1991， 19（2）：1-8.

[2] RUEHLE J L， DONALD H M. Fiber ， food， fuel， and fungal symbionts[J]. Nature， 1979， 206 （26）： 419-422.

[3] PAULA M A， URQUIAGA S， SIJQUEIRA J O. Sygergistic effects of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi and diazotrophicus bacteria on nutrition and growth of sweet potato （Ipomoea batatas）[J] .Biology and Fertility of Soils，1992，14： 61-66.

[4] 赵之伟.菌根真菌在陆地生态系统中的作用[J].生物多样性， 1999，7（3）：240-244.

[5] POWELL C L， BAGYARAJ D J. VA Mycorrhiza[M]. Florida： CRC Press， Inc，1984.

[6] 刘润进，薛炳烨，黄 镇，等.山东果树泡囊-丛枝（VA）菌根调查[J]. 山东农业大学学报，1987，18（4）：25-31.

[7] 陶 诗，刘一令，黄小香，等.春兰菌根真菌的分离及培养条件特征研究[J]. 北方园艺， 2010（16）： 108-111.

[8] 贾东贝，杨 涛，肇 莹，等. 2株越橘菌根培养条件的研究[J]. 江苏农业科学，2011，39（2）：466-468.

[9] 郭顺星，曹文芩，高微微，等.铁皮石斛及金钗石斛菌根真菌的分离及其生物活性测定[J].中国中药杂志，2000，25（6）：338-341.

[10] 盛萍萍，刘润进，李 敏，等. 丛枝菌根观察与侵染率测定方法的比较[J].菌物学报，2011，30（4）：519-525.

[11] 蒋盛岩，张 平，胡劲松，等. 外生菌根菌白毒伞（Amanita verna）菌丝体纯培养条件[J].湖南师范大学自然科学学报， 2002，25（1）：75-77.

[12] 於 虹.蓝浆果栽培与采后处理技术[M].北京：金盾出版社， 2003.

[13] MOSSE B. Plant growth responses to vesicular-arbuscular mycorrhiza. IV. In soil given additional phosphate[J]. New Phytol，1973，72：127-136.

2.7 菌根共生体系建立

通过对樱桃苗根系侵染率及植株成活率进行检测，结果表明，施加菌根真菌的根系侵染率为27.1%，对照组为0；施加菌根真菌的植株成活率为86%，高于对照组的73%。分析结果可知，该菌根真菌经过分离培养仍具有一定的有效性，可以显著提高植株的成活率。

3 讨论

通过用PDA培养基、PDA-抗生素培养基、MMN培养基分离该菌发现，三者对该菌的分离具有明显差异。其中，MMN培养基可以有效减少杂菌的感染量，而PDA培养基和PDA-抗生素培养基杂菌感染量均较高，并且MMN培养基能够明显促进该菌的生长，具体作用机理有待进一步研究。HgCl处理时间对根系感染具有明显的抑制作用，其在6 min内能明显减少杂菌感染量，当超过6 min时，这一作用不太明显。与此同时，处理时间也影响该菌的生长，在处理时间较短时，由于杂菌较多会直接影响到该菌的生长，随着处理时间的延长，杂菌感染量减少，促进该菌生长，但过长的处理时间可能会杀死根系内部的真菌孢子，导致该菌生长减缓。

温度是影响菌根真菌生长的重要因素。一般而言，菌根真菌对温度反应灵敏，20～28 ℃条件下是多数菌根真菌的最适生长温度，而最高耐受温度为35 ℃[11]。该菌的最适温度是25 ℃，但是在35 ℃时仍能生长。通常情况下，菌根真菌喜酸性，在酸性土壤中中接种可以形成菌根[12]。但本研究表明，该菌的最适pH 7，而且在pH 5～10时，pH对该菌生长的影响不明显，这在一定程度上说明菌根真菌的培养与菌根共生体系建立所需要的酸碱环境不一致。P浓度对菌根的形成具有显著的影响，试验证明，当每千克土壤的磷酸二氢钙含量超过6 g时，菌根不能形成[13]。本研究表明，在上述范围内，P浓度对该菌的生长影响不明显。大多数研究表明，不同种类的菌根真菌对C源的利用较为广泛，既可以利用单糖、低聚糖等速效C源，也可以利用淀粉等长效C源。本研究发现，该菌在以可溶性淀粉为C源的培养基中生长最快，其次是蔗糖。本研究发现，该菌对N源的种类要求不高，但以尿素最佳。

本研究通过对该菌有效性进行检测发现，施加该菌可以提高炼苗期樱桃苗的成活率，因此该菌可以制成菌剂应用于炼苗期樱桃苗，对于其他植物的影响有待进一步研究。同时，该菌的侵染率并未达到对樱桃植株侵染率的最大值，相关原因有待研究。

参考文献：

[1] 郝文英.80年代以来VA菌根研究进展[J].土壤学进展，1991， 19（2）：1-8.

[2] RUEHLE J L， DONALD H M. Fiber ， food， fuel， and fungal symbionts[J]. Nature， 1979， 206 （26）： 419-422.

[3] PAULA M A， URQUIAGA S， SIJQUEIRA J O. Sygergistic effects of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi and diazotrophicus bacteria on nutrition and growth of sweet potato （Ipomoea batatas）[J] .Biology and Fertility of Soils，1992，14： 61-66.

[4] 赵之伟.菌根真菌在陆地生态系统中的作用[J].生物多样性， 1999，7（3）：240-244.

[5] POWELL C L， BAGYARAJ D J. VA Mycorrhiza[M]. Florida： CRC Press， Inc，1984.

[6] 刘润进，薛炳烨，黄 镇，等.山东果树泡囊-丛枝（VA）菌根调查[J]. 山东农业大学学报，1987，18（4）：25-31.

[7] 陶 诗，刘一令，黄小香，等.春兰菌根真菌的分离及培养条件特征研究[J]. 北方园艺， 2010（16）： 108-111.

[8] 贾东贝，杨 涛，肇 莹，等. 2株越橘菌根培养条件的研究[J]. 江苏农业科学，2011，39（2）：466-468.

[9] 郭顺星，曹文芩，高微微，等.铁皮石斛及金钗石斛菌根真菌的分离及其生物活性测定[J].中国中药杂志，2000，25（6）：338-341.

[10] 盛萍萍，刘润进，李 敏，等. 丛枝菌根观察与侵染率测定方法的比较[J].菌物学报，2011，30（4）：519-525.

[11] 蒋盛岩，张 平，胡劲松，等. 外生菌根菌白毒伞（Amanita verna）菌丝体纯培养条件[J].湖南师范大学自然科学学报， 2002，25（1）：75-77.

[12] 於 虹.蓝浆果栽培与采后处理技术[M].北京：金盾出版社， 2003.

[13] MOSSE B. Plant growth responses to vesicular-arbuscular mycorrhiza. IV. In soil given additional phosphate[J]. New Phytol，1973，72：127-136.