缝隙连接蛋白43表达对难治性颞叶癫痫手术患者预后价值分析

何利兵，武 江，张培胜，孔 佳，李文玲，赵文清

难治性癫痫是指临床对抗癫痫药物治疗反应差的部分癫痫患者，即两种一线药物规治疗2年以上仍有癫痫发作。颞叶癫痫为临床最常见的难治性部分性癫痫类型，颞叶癫痫占难治性癫痫的60%～70%［1］。颞叶癫痫的手术治疗效果已经得到认可，但手术患者的预后仍存在差异，部分患者手术后仍不能得到很好的改善，如何能够早期判断手术的预后具有重大的临床意义。

缝隙连接（gap junction，GJ）是多种生理功能包括电偶联，细胞间信息传递的结构基础［2］，缝隙连接蛋白（connexin，Cx）是构成缝隙连接通道的基本功能蛋白，细胞内的离子和小分子物质可借此出入相邻细胞，在神经细胞的生长、分化以及生理功能的调节中发挥作用［3］。成年哺乳类动物脑组织中表达最强的是Cx43，主要在星形胶质细胞中表达［4］。研究发现Cx43可能和癫痫的电传导具有密切的关系，但与颞叶癫痫预后的关系研究较少。本研究就颞叶癫痫手术患者的Cx43表达和手术预后情况进行分析。

1 资料与方法

1.1 患者筛选 回顾性分析2009年6月—2012年6月经河北省人民医院功能神经外科进行术前评估和手术治疗的颞叶癫痫病例43例，筛选颞叶皮层组织标本完整，随访资料完善的患者纳入试验组，如果诊断存在争议或者合并存在其他疾病，则排除不进入研究。随访方法包括进行门诊、电话、信件随访。对患者进行随访后，根据患者癫痫发作情况按照Engel标准分级：Ⅰ级，无影响功能癫痫发作（除外术后早期的癫痫发作）；Ⅱ级，仅有稀少的影响功能的癫痫发作；Ⅲ级，癫痫发作得到相当的改善；Ⅳ级，癫痫发作改善不明显［5］。

1.2 免疫组化流程 应用SP法，按照兔抗人Connexin43单克隆抗体（SAB公司，浓度1∶100）试剂说明书进行，制作好的免疫组化切片在Olympus光学显微镜下高倍镜进行定性观察。按照参考文献报道，Cx43在胞浆和胞膜均有表达，判定胞浆和胞膜染成棕黄色为阳性细胞。每张切片随机选取5个视野，PT彩色病理图像分析系统在400倍高倍镜下测量Cx43免疫反应阳性细胞数目。

1.3 统计学处理 全部数据使用SPSS 13.0统计学软件处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料 经筛选后，符合条件者45例，男31例，女14例，年龄14岁～52岁（26.6岁±11.8岁），病程2年～25年，平均9.7年。单纯部分性发作27例，复杂部分性发作39例，全面性发作10例，复杂部分继发全面强直阵挛性发作23例，失神发作1例。所有患者术前均长期服用过数种抗癫痫药物，如丙戊酸钠、卡马西平、氯硝西泮、拉莫三嗪、左乙拉西坦等，平均用药时间5.2年，符合难治性癫痫诊断标准。所有患者术前均行长程视频脑电图检查，42例监测到临床及脑电图发作，脑电图均有异常发现，多为高波幅阵发性或单发棘波、尖波，部分患者出现棘慢波复合波。

所有患者均在全身吸入静脉复合麻醉下手术，以术前脑电图及影像学检查结果为依据，行扩大翼点开颅，手术操作均在显微镜下完成，均行标准颞叶切除术，包括前颞叶、部分海马等内侧结构。术中应用皮层脑电图监测，均可监测出尖波或棘波，将病灶切除后再次进行皮层脑电图监测，直至无明显放电为止。术后常规应用抗癫痫药物，主要以卡马西平为主，平均用量为900 mg／d。

2.2 随访结果 本组患者随访1年～4年，平均2.2年。术后疗效按Engel标准评定，EngelⅠ级30例（66.7%），Ⅱ级9例（20.0%），Ⅲ 级4例（8.9%），Ⅳ级2例（4.4%）。效果优良（EngelⅠ＋ Ⅱ级）39例（86.7%），效果不佳 （EngelⅢ＋ Ⅳ级）为6例（13.3%）。

2.3 免疫组织化学观察 应用免疫组化方法检测Cx43在大脑皮层中的星形胶质细胞明显表达，以胞浆或突起染成棕黄色为阳性。在手术效果良好组中平均每个视野Cx43免疫反应阳性细胞为11.48个±4.36个，在手术效果不佳组中，平均每个视野Cx43免疫反应阳性细胞为27.64个±3.78个，阳性细胞增多明显高于手术效果良好组（P＜0.05）。

3 讨 论

缝隙连接为细胞膜上的一种特殊结构，构成相邻细胞间的通道，信息离子及小分子可经其进行细胞间转运，是目前认为细胞间直接交换物质和信息的通道，是细胞间电突触的结构基础［2］。缝隙连接既存在于同种类型细胞之间，也存在于不同类型的细胞之间，其中中枢神经系统内数量最多的星形胶质细胞之间具有最广泛的缝隙连接，这种结构也构成了大脑内广泛的信息传递网络系统。众多研究发现缝隙连接在中枢神经系统的电活动的维持、同步化放电以及生长发育等诸多方面，都起着重要的作用，癫痫的电生理改变是大脑神经元出现异常的、过度的同步性放电，提示缝隙连接也可能在癫痫的发病机制方面扮演着重要的角色。

缝隙连接蛋白是构成缝隙连接通道的基本功能蛋白，每6个跨膜的蛋白亚基围绕中央孔排列形成一个连接小体，相邻细胞膜上的连接小体对接形成缝隙连接［5］。在细胞间通道形成前，半通道呈关闭状态，而当相邻细胞的半通道连接时，在细胞间形成直径约1.5 nm的通道，细胞内的离子和小分子物质可借此出入相邻细胞。目前，缝隙连接蛋白是由多基因家族编码的一大类膜蛋白，由许多成员组成，在哺乳动物中发现的连接蛋白至少有20种，分子质量26 k D～56 k D，其中有9种Cx在成年或发育中的中枢神经系统中有不同程度的表达（Cx26，Cx32，Cx33，Cx36，Cx37，Cx40，Cx43，Cx45，Cx46），成年哺乳类动物脑组织中表达最强的是Cx43，Cx43是Cx基因家族中数量最为丰富的成员，主要在星形胶质细胞中表达［6］。

许多研究表明，Cx43在癫痫的发生发展过程中有密切关系［7］。有研究发现，Cx43随癫痫的病情发展而表达上调，Cx43的表达强度受癫痫发作时间的影响，癫痫发作的时间越长，Cx43表达就越多，因此，认为Cx43很可能与癫痫发作后脑组织结构的重塑有密切关系［8］。有学者利用用免疫组化方法和Western blot方法测定海人藻酸致痫后大鼠不同脑区、不同时间的Cx43的分布及表达情况，结果显示海人藻酸致痫后大鼠的大脑皮层及海马均有Cx43阳性表达，其表达与致痫时间呈正相关，发作时间越长，表达越明显［9］。其有关机制可能是Cx43的表达增高促进了缝隙连接的形成，增加了新的电突触数目和电传导性，导致神经元同步化放电的扩大而引起癫痫。

另外，有研究认为广泛的缝隙连接使星形胶质细胞成为一个功能合胞体，当癫痫发作时，由于大量的Ca2＋进入了神经元内导致细胞外Ca2＋降低，细胞外Ca2＋减少对痫样放电的同步化扩散及发作起重要作用，星形胶质细胞兴奋引发的Ca2＋内流会在这个功能合胞体中播散开来，称为Ca2＋波，对神经调节具有重要意义。Cx43基因敲除后，可以导致星形胶质细胞间的缝隙连接传导及Ca2＋流减弱，但Cx30，Cx40等其他Cx表达未受影响，这说明Cx43在中枢神经系统的生理活动中有着相对其他Cx更重要的作用［10］。

有研究对于手术切除难治性癫痫患者致痫灶分析发现Cx43 mRNA明显升高，这可能由于癫痫发生部位的神经元过度同步化放电，使细胞外释放的K＋增加，为了清除过多的K＋，星形胶质细胞使Cx43 mRNA表达代偿性增加，缝隙连接数目增加，使清除K＋的能力增加，有利于维持神经元的正常环境稳态［6］。有研究采用难治性颞叶癫痫患者的海马组织及正常人的海马组织进行对照研究，应用免疫荧光标记星形胶质细胞激光共聚焦显微镜测量Cx43表达水平，结果发现，颞叶癫痫患者的海马组织中星形胶质细胞中Cx43表达增多，Cx43含量相对于对照组明显增加，说明这种Cx43的显著表达可能加重颞叶癫痫患者的发作程度［11］。

对于颞叶癫痫的治疗策略仍就认为手术是最佳的治疗手段，完整的切除前颞叶和海马等内侧结构，是获得疗效最佳的策略［12］。本研究也验证了这种观点，所有的患者均进行标准前颞叶切除术，切除范围包括前颞叶及海马结构，取得了良好的手术效果，效果优良（EngelⅠ＋ Ⅱ级）达到86.7%。对于颞叶癫痫的手术效果，可能与多种因素有关，但均不十分确定，唯一公认的影响手术预后的因素为不完全切除［13］，目前还没有分子生物学指标能够对颞叶癫痫的手术预后有所提示。

本研究发现，对于手术效果不佳组颞叶癫痫患者Cx43表达较手术效果良好组明显增高，提示此类癫痫患者已经建立了广泛的细胞间的缝隙连接，构成了放电泛化的基础，部分性的颞叶切除后其他部分可能仍存在癫痫放电，由此分析Cx43对于颞叶癫痫手术的预后可能具有一定的参考价值，缝隙连接蛋白阻断剂可能是未来抗癫痫药物的发展方向。

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