JAK2/STAT4信号通路在运动所致大鼠Th1/Th2失衡中的作用

赵广高++苏全生++周石++苏利强++张玮

摘 要：通过游泳训练诱发大鼠Th1/Th2失衡，观察和分析JAK2/STAT4通路及其上游因子在该失衡发展过程中的变化规律，探讨大运动量训练导致Th1/Th2失衡的分子机制。将清洁级16周龄雄性SD大鼠随机分为安静对照组（C组）、游泳训练组（T组），每组根据取材时间不同又随机分为24 h组与7 d组。训练采用4周递增负荷游泳训练方法。Western Blotting法测定心脏血淋巴细胞pJAK2、pSTAT4、JAK2、STAT4的蛋白表达，ELISA法检测心脏血血浆IFN-γ、IL-4、IL-12值。结果发现：（1）T组大鼠血浆IFN-γ、IFN-γ/IL-4与IL-12（P<0.01）水平均显著低于C组（P<0.01）、（P<0.05）。C组与T组大鼠血浆IL-12与IFN-γ的质量浓度显著相关（P<0.01）。（2）T组大鼠血淋巴细胞pJAK2、pSTAT4蛋白表达均显著低于C组（P<0.05）、（P<0.01）。结果说明4周递增负荷训练可能通过减少IL-12的分泌，抑制JAK2/STAT4信号通路中关键因子JAK2、STAT4的磷酸化过程，降低Th1类细胞因子IFN-γ的合成，诱发Th1/Th2失衡。

关 键 词：运动生理学；Th1/Th2平衡；Janus激酶-2；信号传导与转录激活因子-4；白细胞介素-12；γ-干扰素；白细胞介素-4

中图分类号：G804.2 文献标志码：A 文章编号：1006-7116（2014）05-0139-06

Roles played by JAK2/ STAT4 signaling pathways in rats Th1/Th2

imbalance induced by exercising

ZHAO Guang-gao1，SU Quan-sheng2，ZHOU Shi3，SU Li-qiang4，ZHANG Wei4

（1.Department of Physical Education，Nanchang University，Nanchang 330031，China；

2.Chengdu Sport University，Chengdu 610041，China；3.School of Health and Human Sciences，

Southern Cross University，Lismore，NSW 2480，Australia；4.Division of Physical Education，

Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China）

Abstract： By means of swimming training， the authors induced rats Th1/Th2 imbalance， observed and analyzed the patterns of changing of JAK2/STAT4 pathways and their upstream cytokines in the process of development of such an imbalance， so as to probe into the molecular mechanism of intensive training inducing the Th1/Th2 imbalance. The authors randomly divided 16-week old male SD rats graded clean into a calm control group （group C） and a swimming training group （group T）， then randomly divided each of these groups into a 24h group and a 7d group according to different sampling times， carried out the training by using the 4-week load progressively increased swimming training method， measured the protein expressions of pJAK2， pSTAT4， JAK2 and STAT4 in cardiac blood lymphocytes by using the western blotting method， measured the contents of IFN-γ， IL-4 and IL-12 in cardiac blood plasma by using the ELISA method， and revealed the following findings： 1） the levels of IFN-γ， IFN-γ/IL-4 and IL-12 in blood plasma of the rats in group T were all significantly lowered that those of the rats in group C （P<0.01， P<0.05， P<0.01）； the contents of IL-12 and IFN-γ in blood plasma of the rats in groups C and T were significantly correlative （P<0.01）； 2） the protein expressions of pJAK2 and pSTAT4 in blood lymphocytes of the rats in group T were all significantly lowered that those of the rats in group C （P<0.05， P<0.01）. The said findings indicate that the 4-week load progressively increased training may induce the Th1/Th2 imbalance by reducing the secretion of IL-12， suppressing the process of phosphorylation of key cytokines JAK2 and STAT4 in JAK2/STAT4 signaling pathways， and reducing the synthesis of type Th1 cytokine IFN-γ.endprint

Key words： sports physiology；Th1/Th2 balance；JAK2；STAT4；IL-12；IFN-γ；IL-4

过量运动引起的免疫失衡及其分子机制是目前研究的热点问题[1]。作为反映细胞免疫与体液免疫平衡关系的重要指标，Th1/Th2平衡常用于评价运动中机体的免疫机能。现有的研究成果已基本阐明了Th1/Th2平衡在不同运动中的变化规律[1]，其中大运动量训练对Th1反应的抑制作用也已由实验研究所证实[2-4]。在此基础上，研究者们参考了Th1/Th2平衡自身的调控因素，来研究大运动量训练诱发Th1/Th2失衡过程中各种调节因素的作用[5-7]，试图揭示该失衡发生的分子机制。

基础研究认为，细胞因子介导的Janus激酶/信号传导与转录激活因子（JAK/STAT）信号通路在Th1、Th2的分化过程中起决定性作用[8-10]。其中，白细胞介素（IL）-12介导的JAK2/STAT4通路诱导Th1分化，JAK2、STAT4的磷酸化是该通路激活的重要标志[11-12]。而大运动量训练后Th1/Th2平衡的变化是否与JAK2/STAT4信号通路的状态有关，目前尚需实验予以证实。基于此，本研究采用长时间递增负荷训练的方法建立大鼠Th1反应抑制模型，探讨JAK2/STAT4通路及其上游细胞因子在训练中的变化特点及其与Th1反应的关系，旨在为运动免疫学相关理论的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级16周龄雄性SD大鼠32只，体重（456±38） g，饲养环境温度18～25℃，相对湿度40%～60%，自然光照，自由饮食饮水。将大鼠随机分为安静对照组（C组，n=16只）、游泳训练组（T组，n=16只）。T组又随机分为末次训练后24 h组（T1）与末次训练后7 d组（T2）；C组也随机分为C1、C2组，每小组各8只，分别与T1、T2组同时间段取材。

1.2 运动模型

大鼠购回适应性饲养3 d后，T组大鼠进行4周递增负荷游泳训练（第1周，10～90 min无负重；第2周，90～135 min无负重；第3周60～105 min，负重1%体重；第4周，105～180 min，负重1%体重），每周训练5 d。前2周大鼠为无负重游泳，逐日递增游泳时间，用以训练大鼠的游泳水平，并逐渐提高其耐力。后两周负重1%体重，游泳时间仍逐渐增加，时间增加的幅度根据大鼠每天训练后的疲劳程度与第2天的活动状态而定。负重为串有一定重量螺丝帽的钥匙环，通过小皮筋绑定于大鼠双上肢腋下。训练期间未完成规定运动时间就出现动作明显不协调、沉入水底后不能保持站立姿势的大鼠，迅速捞起后用干毛巾擦干后休息5 min后，再放入水中游泳，并使之总游泳时间达到当日要求。

1.3 测试样本的采集与处理

T组大鼠末次训练后24 h、7 d根据体重用质量分数为10%的水合氯醛（0.0003 mL/g）腹腔注射麻醉并取心脏血。C1、C2组分别与T1、T2组同时间段取血。共取血2管，每管2.5 mL，均置于EDTA抗凝剂真空管中。一管静置30 min后，3 000 r/min离心5 min，分离血浆用于检测IFN-γ、IL-4、IL-12质量；另一管分离淋巴细胞，用于测定pJAK2、pSTAT4、JAK2、STAT4蛋白表达。

1.4 指标检测方法

1）血浆IFN-γ、IL-4、IL-12质量浓度。

血浆细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-12含量均采用ABC-ELISA检测。将抗大鼠细胞因子单抗包被在酶标板上，使标准品与样品中的细胞因子和单抗结合，之后加入生物素化的抗大鼠细胞因子，形成免疫复合物连接于板上，用辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素与生物素结合，加入底物工作液后显蓝色，最后加终止液硫酸，在450 nm处测光密度，细胞因子浓度和光密度值成正比，通过绘制标准曲线来求出标本中的细胞因子含量。所有检测药盒均由上海西唐生物科技有限公司提供。

2）血淋巴细胞pJAK2、pSTAT4、JAK2、STAT4蛋白表达。

血淋巴细胞pJAK2、pSTAT4、JAK2、STAT4蛋白表达均采用Western Blotting法。提取后的淋巴细胞加入细胞裂解液，匀浆、超声破碎并离心后取上清得总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。加5×SDS上样缓冲液；10% SDS-PAGE分离蛋白样品，恒流（30 mA）电泳，待Marker开始分离，转为恒流（40 mA）电泳；将蛋白质分离转移到NC膜上；90 V恒压转膜，90 min；室温下将NC膜用5%脱脂牛奶（用TBST配制）封闭1 h；用兔抗JAK2（1︰800）、兔抗pJAK2（1︰500）、兔抗STAT4（1︰800）、兔抗pSTAT4（1︰500）或鼠抗β-actin抗体（1︰5 000） 4℃孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h。之后进行化学发光、显影、定影，并用凝胶图象处理系统分析光密度值。所有检测药盒均由Cell Signaling公司提供，试剂β-actin-Mouse mAb由Sigma公司提供。

1.5 数据处理

实验结果借助SPSS 17.0软件进行统计处理。组间比较采用单变量方差分析（Univariate Analysis of Variance），首先检测训练效应和时相效应两个主效应，之后对两种因素的交互作用进行检测（训练×时相）。同时相不同组别与同组别不同时相间的差异水平用Bonferroni法进行多个比较的调整。两种不同测试指标间的相关系数通过Pearson相关性来检验。显著性差异水平设定为P<0.05，非常显著性差异水平设定为P<0.01。

2 研究结果

2.1 血浆IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4与IL-12水平的变化endprint

主体间效应的检验显示，训练可导致大鼠血浆IFN-γ、IFN-γ/IL-4与IL-12水平均显著低于C组（P<0.01、P<0.05、P<0.01），对大鼠血浆IL-4含量无显著影响；4指标不同时相间均无显著性变化（图1）。此外，对4指标两主效应间交互作用的检验也均未见显著性差异。

从同时相不同组别间的比较来看，训练后24 h与7 d血浆IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4与IL-12水平均分别低于安静对照组同时相，其中训练后24 h、7 d血浆IFN-γ质量浓度与训练后7 d血浆 IL-12含量变化差异显著。同组别不同时相间，训练后7 d血浆IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4与IL-12水平均低于训练后24 h时相（P>0.05）（见图1）。

T组与C组比较：1）P<0.05；2）P<0.01

图1 T组与C组血浆IFN-γ、IL-4、IL-12质量浓度及IFN-γ/IL-4值的比较

2.2 血浆IL-12与IFN-γ含量的相关性

从Pearson相关性检验结果来看，统计范围为全部大鼠的血浆IL-12与IFN-γ的质量浓度显著相关（r=0.907，P<0.01），统计范围为两安静对照组大鼠的两指标质量浓度也显著相关（r=0.913，P<0.01），统计范围为两训练组大鼠的两指标质量浓度同样呈显著相关（r=0.857，P<0.01）。

2.3 大鼠血淋巴细胞JAK2、pJAK2、STAT4、pSTAT4水平的变化

从主体间效应的检验结果来看，训练可导致血淋巴细胞pJAK2与pSTAT4蛋白表达显著下调（P<0.05、P<0.01），对JAK2与STAT4无显著性影响；4指标不同时相间均无显著性变化（见图2）。此外，对4指标两主效应间交互作用的检验也均未见显著性差异。

在同时相不同组别间的比较上，训练后24 h与7 d血淋巴细胞pJAK2与pSTAT4蛋白表达均低于安静对照组同时相，其中训练后7 d血淋巴细胞pSTAT4表达变化差异显著。同组别不同时相间，训练后7 d血淋巴细胞pJAK2与pSTAT4蛋白表达水平低于训练后24 h时相，但未呈现显著性差异（见图2）。

T组与C组比较：1）P<0.05，2）P<0.01

图2 T组与C组血淋巴细胞JAK2、pJAK2、STAT4、pSTAT蛋白表达的比较

3 讨论

3.1 训练对Th1/Th2平衡的影响

长周期、大运动量训练可导致受试机体脾脏或外周血淋巴细胞中Th1细胞数量、Th1细胞分泌IFN-γ的水平或外周血IFN-γ含量显著降低，引起Th1反应抑制，诱发Th1/Th2失衡[2-4]。在Th1/Th2平衡的评价方法中，外周血细胞因子IFN-γ、IL-4含量也已被许多学者在运动科学研究中逐渐采用[4，13]。本研究结果显示，4周递增负荷训练可引起大鼠血浆IFN-γ质量浓度显著降低（P<0.01）（见图1），提示本实验训练方案可有效抑制Th1反应，导致细胞免疫功能低下。比较训练后两个取材时相的实验结果发现，训练后7 d血浆IFN-γ质量浓度低于训练后24 h时相，比安静对照组的抑制作用也更为显著，提示Th1反应的抑制作用在训练之后的一段时间内呈加重趋势，该实验结果与Wang Ru等[3]的研究结果相一致。

为了更直观地反映运动过程中的Th1/Th2平衡，有学者将运动前后Th1、Th2细胞数量的比例或IFN-γ、IL-4含量的比值（或IFN-γ mRNA/IL-4 mRNA值）作为Th1/Th2平衡的一个评价指标[4，14-15]。本研究测定了4周递增负荷训练后血浆IFN-γ/IL-4比值的变化情况，结果发现，训练可引起大鼠血浆IFN-γ/IL-4值显著降低（P<0.05），与苏利强等[4]的研究结果相一致。而训练后7 d IFN-γ/IL-4值则低于训练后24 h时相（见图1）。该结果进一步说明4周递增负荷训练可导致Th1型免疫反应抑制为主的Th1/Th2失衡，该失衡在训练后24 h至7 d阶段呈加重的趋势。

3.2 训练对IL-12介导的JAK2/STAT4通路的影响

在Th细胞分化的过程中，细胞因子启动的JAK/STAT信号通路的状态起关键作用。其中，IL-12启动的JAK2/STAT4通路介导Th1细胞分化[116]。IL-12主要由抗原提呈细胞（APC）中的树突状细胞分泌，是启动Th1细胞分化过程的关键细胞因子[17]。研究表明，当用抗IL-12的抗血清耗尽IL-12或基因敲除IL-12时，Th1细胞的分化便受到抑制[18]。JAK2/STAT4信号通路归属于非受体酪氨酸激酶信号通路，是细胞因子IL-12诱导Th1细胞分化过程中非常重要的传导途径。其中，JAK2是一种胞质内的非受体型可溶性酪氨酸蛋白激酶，是JAK的家族成员之一。研究表明，JAK2缺失细胞不能表达Th1类细胞因子IFN-γ[19]。STAT4归属于一种能与靶基因调控区DNA结合的胞浆蛋白家族——STAT。当STAT4基因被敲除时，小鼠会发生Th1细胞生成障碍与Th1细胞缺陷的临床表现[20]。

目前，运动科学领域中对IL-12与Th1/Th2平衡关系的研究还不多见。西班牙学者Giraldo等[21]发现，无论是在55%VO2max强度下持续45 min，还是在70%VO2max强度下持续1 h的自行车运动后，健康女性外周血血清IL-12与IFN-γ的含量在运动后即刻与24 h的变化趋势均相一致。美国学者Kohut等[22]发现，一次递增跑台速度至力竭的运动后，对实验小鼠施加HSV-1病毒感染，病毒感染2 d后小鼠脾细胞分泌的IL-12与IFN-γ均显著降低；感染7 d后IL-12仍显著低于对照组，体现了它对Th1分化抑制的长效性，但IFN-γ恢复至安静组水平，其原因尚不清楚。此外，日本学者Suzuki等[23]测定了力竭运动后运动员血浆细胞因子含量的变化。结果发现，作为IL-12的拮抗剂[24]，血浆IL-12p40在运动后显著升高，而IFN-γ活性下降，但血浆IL-12的含量在实验中未检出。目前尚未见长时间运动训练干预机体IL-12的实验报道。endprint

运动条件下Th1/Th2平衡与JAK2/STAT4信号通路关系方面，目前未见到JAK2测定的相关实验报道。STAT4方面，研究者将分别诱导Th1和Th2应答的转录因子STAT4和GATA3作为一对指标，用PCR实验技术探讨了9周递增负荷运动过程中大鼠外周血白细胞STAT4 mRNA、GATA3 mRNA表达量的变化情况[7]。结果发现，9周训练后大鼠STAT4/GATA3显著低于对照组同时相，而1周的中等强度运动后大鼠STAT4/GATA3高于对照组同时相，且STAT4/GATA3与IFN-γ/IL-4的变化趋势相一致。然而，STAT4 mRNA指标本身的变化情况文献并未报道。

本研究在测定血浆IFN-γ质量浓度的同时，测定了同一血样血浆IL-12质量浓度量与血淋巴细胞pJAK2、pSTAT4表达的变化情况。结果发现，4周递增负荷训练可导致大鼠血浆IL-12含量显著降低（P<0.01），训练后7 d血浆IL-12质量浓度量低于训练后24 h时相（见图1）。且各实验大鼠血浆IL-12与IFN-γ的质量浓度显著相关（r=0.907，P<0.01）。此外，训练还导致了血淋巴细胞pJAK2与pSTAT4蛋白表达显著下调，而训练后7 d血淋巴细胞pJAK2与pSTAT4的蛋白表达水平均低于训练后24 h时相（图2）。以上结果提示：4周递增负荷训练可能影响了APC细胞的分泌作用，导致IL-12生成减少。在与Th1细胞细胞膜上IL-12R发生作用时，不能提供充足的p35来结合IL-12R2，一定程度上抑制了JAK2相互聚集，并通过交互自身磷酸化作用而活化的反应过程。同时，IL-12R上的酪氨酸残基的磷酸化作用也减弱，无法为STAT4提供足够的停泊位点。在这样的内环境中，STAT4羟基酪氨酸磷酸化而激活为pSTAT4的作用受到抑制。由pSTAT4单体聚合形成的、用于穿越核膜识别其特异的DNA上的靶序列、启动IFN-γ mRNA转录的pSTAT4同源二聚体也生成减少（见图3）。因此，Th1细胞合成IFN-γ的能力相对降低，分泌到血浆中的IFN-γ质量浓度也显著下降。训练对这一过程的抑制作用可以持续到末次训练后7 d。需要指出的是，本研究尽管为JAK2/STAT4通路及其上游因子在运动中Th1/Th2失衡的作用机制提供了实验依据，但仍存在着不足之处：如研究中缺乏Th1细胞功能抑制的直接证据——Th1细胞分泌IFN-γ的水平与IFN-γ mRNA表达的变化指标，这也将是我们下一步研究需要解决的问题之一。

Y代表酪氨酸残基，P代表磷酸化过程，↓代表显著降低，

-代表抑制作用

图3 4周递增负荷训练后JAK2/STAT4通路及

上游细胞因子的变化

此外，本研究还测定了各组大鼠血淋巴细胞JAK2、STAT4的表达情况。结果发现，4周递增负荷训练对血淋巴细胞JAK2与STAT4蛋白表达并无显著影响（见图2）。由此可见，训练对JAK2与STAT4的表达影响不大，主要通过抑制其磷酸化过程，来抑制JAK2/STAT4信号通路的作用。

4周递增负荷训练可有效抑制大鼠Th1免疫反应，诱发Th1/Th2平衡向Th2方向漂移，导致免疫失衡。该失衡作用可在训练后维持一段时间。

4周递增负荷训练可能通过减少大鼠Th1细胞启动因子IL-12的分泌，抑制JAK2/STAT4信号通路中关键因子JAK2、STAT4的磷酸化过程，降低Th1类细胞因子IFN-γ的合成。IL-12介导的JAK2/STAT4通路的抑制可能是大运动量训练导致Th1/Th2失衡的分子机制之一。

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