复方郁金散治疗鸡大肠杆菌病试验研究

吕贵斌

为研究复方郁金散治疗鸡大肠杆菌病疗效情况，实验中对某疑似鸡大肠杆菌病的病例进行病原分离鉴定，确定其病原为致病性大肠杆菌。在此基础上，选用复方郁金散、白头翁散、黄连解毒汤、五味消毒饮、公英散进行中药药敏实验。从中发现，复方郁金散对大肠杆菌高敏感。且用复方郁金散对患有大肠杆菌病的鸡只进行治疗，取得较好效果。

一、材料

1.病料 疑似大肠杆菌病的鸡、小白鼠。

2.实验药物 中药方剂复方郁金散（郁金150克、黄柏90克、黄芩90克、栀子80克、白芍80克、茯苓80克、诃子60克、甘草60克、黄连30克），黄连解毒汤，五味消毒饮，公英散，白头翁汤。

3.仪器及培养基 ①仪器。超净工作台、冰箱、高压灭菌器、恒温培养箱、生化培养箱、显微镜、天平、酒精灯。②培养基。普通琼脂培养基、麦康凯培养基、三糖铁培养基、伊红美兰培养基、五糖发酵管、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、枸橼酸盐培养基、尿素琼脂培养基。

二、方法

1.病料分离培养 无菌采集发病鸡粪便，划线接种于伊红美兰培养基上，37℃培养24小时，观察其生长情况。取伊红美兰琼脂上菌落的一部分进行革兰氏染色，油镜下检查菌体形态染色特点，对分离菌进行初步鉴定。

2.生化实验 取可疑菌落另一部分在三糖铁斜面表面划线，之后深部穿刺。①五糖发酵实验。取三糖铁培养基上的可疑菌落分别接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖，37℃培养，24～48小时后观察其生长情况，并记录结果。②吲哚实验。取三糖铁上可疑菌落接种至蛋白胨水培养基中，置37℃恒温培养48～72小时，取出，沿管壁缓慢加入吲哚试剂1毫升，观察结果。③甲基红实验。取三糖铁上可疑菌落接种至葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃恒温培养24～48小时，取出，滴加数滴甲基红试剂至培养液中，摇匀观察结果。④二乙酰实验。取三糖铁上可疑菌落接种至葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃恒温培养48～72小时，取出，加入二乙酰试剂甲液0.6毫升，乙液0.2毫升，摇匀，静置15～20分钟观察结果。⑤枸橼酸盐实验。取三糖铁上可疑菌落接种至枸橼酸盐培养基斜面上，经37℃恒温培养24～48小时，观察结果。⑥尿素实验。取三糖铁上可疑菌落，接种尿素琼脂斜面，不穿刺到底部，下部留作对照。37℃恒温培养24～48小时，观察结果。

3.动物回归试验 取相同条件下小白鼠10只，分为2组，每组5只。第一组5只小白鼠腹腔注射大肠杆菌液1.5毫升，另一组5只小白鼠腹腔注射同等剂量的生理盐水，作为对照组，正常情况下饲养，进行观察。

4.中药药敏实验 ①普通营养琼脂制备。将玻璃平皿洗净晾干。用干燥灭菌箱120℃灭菌1小时。将消毒好的琼脂趁热通过玻璃棒引入平皿，每皿需20～25毫升琼脂液，琼脂厚度3～4毫米，倒完盖上平皿，凉透放入冰箱备用。②药敏片制备。将滤纸片用打孔器或剪刀剪成小圆形或小正方形，用干燥灭菌箱灭菌备用。③接种病原大肠杆菌。死鸡内脏大肠杆菌含菌量很高，因此可以直接用接种环蘸取病死鸡内脏组织（肝、心包、气囊等），然后均匀涂布于琼脂表面，但注意不要划破琼脂，然后在平皿底壁中心及四周用钢笔写上药物名称（一般一个平皿做5种药物）。④中药药液制备。复方郁金散、白头翁散、黄连解毒汤、五味消毒饮、公英散，每种中药准确称取10克粉碎后，用纱布包好，放入1000毫升烧杯内，煎药时间按药性不同确定。根据煎药时间不同，加入200～400毫升自来水，浸泡1小时，然后用电炉分别煎30分钟，过滤。沉渣再加1∶8或1∶5自来水继续煎30分钟，过滤。将灭菌干燥好的药敏片浸入煎煮好的复方郁金散、白头翁散、黄连解毒汤、五味消毒饮、公英散药液中。浸入数分钟后，再用细针头蘸取药片贴到琼脂上（与所写药名的位置对应），最后放入恒温箱37℃培养，18～20小时观察结果。⑤药物敏感性判定。抑菌圈直径与药物敏感性关系如下：抑菌直径>20毫米为极敏感；抑菌直径在15～20毫米为高敏感；抑菌直径在10～14毫米为中敏感；抑菌直径<10毫米为低敏感；抑菌直径为0不敏感。

三、结果

1.涂片染色镜检 革兰氏染色镜检，见到革兰氏阴性、散在的小杆菌。

2.菌落形态及培养 伊红美兰琼脂上为许多圆形或椭圆形黑色略带金属光泽的菌落。

3.大肠杆菌的生化结果

4.动物回归实验结果 注射生理盐水的小白鼠精神状态良好，无发现任何发病症状。注射大肠杆菌液的小白鼠第一天死亡1只，第二天死亡2只，第三天死亡1只，1只耐过。取发病死亡的小白鼠的心脏、肝脏组织，进行革兰氏染色涂片镜检，镜下为单在或成对、散在的粉红色菌落。

5.中药药敏实验结果 从恒温培养箱取出琼脂平板，用带有刻度的尺子测量抑菌圈直径，复方郁金散抑菌圈直径为18毫米，对大肠杆菌高敏感；白头翁散抑菌圈直径为12毫米，对大肠杆菌中敏感；黄连解毒汤抑菌圈直径14毫米，对大肠杆菌中敏感；公英散抑菌圈直径8毫米，对大肠杆菌低敏感；五味消毒饮未见有抑菌圈出现，对大肠杆菌不敏感。

通过本次试验研究，对可疑大肠杆菌病鸡的病原菌进行分离培养鉴定，染色特性，培养特性，生化特性，动物回归实验与大肠杆菌标准特性基本一致。由此可确定为大肠杆菌。

四、临床治疗

用大剂量复方郁金散对患有大肠杆菌病的鸡只进行治疗，有效降低鸡只死亡率及发病率。城子坦某鸡场今年暴发两次大肠杆菌病，均用复方郁金散对鸡群进行治疗。第一批鸡场共1万只鸡，1000只鸡发病，用复方郁金散治疗，治愈980只，死亡20只。第二批共9000只鸡，发病500只，治愈470只，死亡30只。与其他药物相比，治愈率较高，死亡率很低。

五、结论

1.通过分离培养鉴定、涂片镜检、生化试验、动物回归试验，确为致病性大肠杆菌。

2.药敏实验结果显示复方郁金散对大肠杆菌高敏感。

3.临床治疗，用复方郁金散对鸡进行治疗，表明复方郁金散治疗效果较好。