丹皮总黄酮的提取及抗氧化活性研究

丁彩真，于曙光，王艳丽，金玉波，郑国生

（1.青岛农业大学化学与药学院，山东 青岛266109；2.即墨市第二中学，山东 即墨266214；3.青岛农业大学生命科学学院，山东 青岛266109）

丹皮，又名牡丹皮，为毛茛科植物牡丹的干燥根皮，具有清热凉血、活血散瘀的功效，用于治疗血滞经闭、痛经、痈肿疮毒、跌扑伤痛、温毒发斑等症[1］。现代药理学研究表明，丹皮具有保护心血管系统、抗菌、消炎等作用[2］。丹皮中含有牡丹酚（paeonol）、牡丹酚甙（paeonoside）、牡丹酚原甙（paeonolide）、牡丹酚新甙（apiopaeonoside）、芍药甙（paeoniflorin）、氧化芍药甙（oxypaeoniflorin）、苯甲酰芍药甙（benzoyl－paeoniflorin）、苯甲酰氧化芍药甙（benzoyl－oxypaeoniflorin）、没食子酸（gallic acid）、挥发油、植物甾醇、蔗糖、黄酮类化合物等[3－4］。近年来，人们对丹皮的研究主要集中于丹皮酚及其衍生物的生物活性[5－7］，而对丹皮中含有的生物类黄酮研究较少。研究表明，生物体内的黄酮类化合物具有较强的生物活性[8－11］，如抗氧化、抗肿瘤、抗HIV等，同时对心脑血管疾病具有明显的改善作用。丹皮中生物类黄酮的研究和开发也日益得到人们的重视[12］。

作者以丹皮为原料提取丹皮总黄酮并测定其含量，以常用的抗氧化剂 2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚（BHT）和叔丁基对苯二酚（TBHQ）为对照，采用4种方法评价丹皮总黄酮的抗氧化活性，以期从丹皮中提取得到高效抗氧化的生物类黄酮，为资源丰富的牡丹在医药、食品等领域的综合开发利用开辟新的途径。

1 实验

1.1 材料与试剂

2013年10～11月份采挖青岛农业大学牡丹种植基地3～5年生凤丹的壮硕根部，剥取根皮，晒干。

石油醚、乙醇、乙醚、丙酮、硫酸、苯酚、硫酸钠、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、葡萄糖、三氯乙酸、硫代巴比妥酸（TBA）、邻苯三酚、盐酸、H2O2、FeSO4、BHT、二苯代苦味肼基自由基（·DPPH）、芦丁、TBHQ，均为分析纯。

1.2 丹皮总黄酮的提取与含量测定

参照刘昌平[13］提取金银花中总黄酮的方法：取一定量丹皮，以乙醚为抽提剂，用索氏提取法脱脂并除去脂溶性色素；挥干乙醚，用75%乙醇回流提取得到丹皮总黄酮粗提物；浓缩，干燥，得到粉末即丹皮总黄酮样品。

以30%乙醇为溶剂配制系列芦丁标准品溶液，绘制标准曲线，得到拟合回归方程为c＝0.0105A－0.0116，R2＝0.9989。然后以丹皮总黄酮样品20.0 mg取代芦丁，测定丹皮总黄酮样液的吸光度。按回归方程计算样品中丹皮总黄酮含量，并计算其在丹皮中的含量。

1.3 丹皮总黄酮抗氧化活性评价

分别测试不同浓度的丹皮总黄酮样液对·DPPH、羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基的清除率以及对小鼠肝组织脂质过氧化的抑制率，以相同浓度的抗氧化剂（BHT和TBHQ）为对照，综合评价丹皮总黄酮的体外抗氧化活性。

1.3.1 对·OH清除率的测定

采用Fenton反应（亚铁离子催化过氧化氢产生·OH）[14－15］，在λ＝536nm处测定反应混合物的吸光度（用蒸馏水调零），按式（1）计算丹皮总黄酮对·OH清除率（D1）：

式中：AP为1.0mL蒸馏水的空白吸光度；As为1.0mL的丹皮总黄酮样液的吸光度；Ab为用1.0mL 30%乙醇代替1.0mL过氧化氢时测得的吸光度。

参照范秀萍等[16］的方法，在λ＝299nm处测定反应混合物的吸光度（用蒸馏水调零），按式（2）计算丹皮总黄酮对·O－2清除率（D2）：

式中：A0为0.1mL蒸馏水的空白吸光度；A1为0.1mL丹皮总黄酮样液的吸光度。

1.3.3 对·DPPH清除率的测定

参照彭长连等[17］的方法，在λ＝517nm处测定吸光度，按式（3）计算丹皮总黄酮对·DPPH清除率（D3）：

式中：A0为2.0mL乙醇的空白吸光度；A1为2.0mL丹皮总黄酮试液的吸光度（需要用2.0mL乙醇与2.0mL样液混匀后调零，以排除样液本身颜色的影响）。

1.3.4 对小鼠肝组织脂质过氧化抑制率的测定

参照郑晶泉[18］的方法（TBA 法），在λ＝532nm处测其吸光度，按式（4）计算丹皮总黄酮对脂质过氧化抑制率（D4）：

式中：A0为0.2mL蒸馏水的空白吸光度；A1为0.2mL丹皮总黄酮样液的吸光度（需要用蒸馏水代替TBA混匀后调零）。

1.3.5 半抑制浓度（IC50）的测定

参照徐清萍等[19］的方法计算各抗氧化测试反应的半抑制浓度（IC50）。

2 结果与讨论

2.1 丹皮总黄酮的含量分析

丹皮总黄酮样品中总黄酮含量为56.72%，在丹皮中的含量为1.6304%。

2.2 丹皮总黄酮的抗氧化活性

2.2.1 丹皮总黄酮对自由基的清除率及对脂质过氧化的抑制率

不同浓度的丹皮总黄酮以及BHT和TBHQ对自由基·OH、、·DPPH的清除率以及对脂质过氧化的抑制率见表1 。

表1 不同浓度下，丹皮总黄酮、BHT和TBHQ对自由基的清除率及对脂质过氧化的抑制率Tab.1 The scavenging rate of radicals and inhibition rate of lipid peroxidation of the total flavonoids fromTree peony bark，BHT and TBHQ at different concentrations

比较相同浓度的丹皮总黄酮、BHT和TBHQ对不同自由基清除率及对脂质过氧化抑制率发现，三者均符合对·OH清除率＞对·DPPH清除率＞对·O－2清除率＞对小鼠肝组织脂质过氧化抑制率的规律。说明3种抗氧化物质可能具有类似的抗氧化机制，推测它们可能具有类似的结构。

比较相同浓度的丹皮总黄酮、BHT和TBHQ对相同自由基清除率及脂质过氧化抑制率发现，基本上符合TBHQ≥丹皮总黄酮＞BHT的规律。BHT是目前国内外广泛使用的油溶性抗氧化剂，TBHQ是在美国、日本已广泛使用的效果较好的抗氧化剂，丹皮总黄酮的抗氧化活性略低于或等于TBHQ的抗氧化活性，且远远大于BHT的抗氧化活性，在较低浓度下即具有较好的氧化反应抑制作用。

2.2.2 半抑制浓度

在同一体系中，半抑制浓度IC50越小，表明样品清除自由基的能力越强。丹皮总黄酮、BHT和TBHQ对不同氧化反应的半抑制浓度如表2 所示。

表2 丹皮总黄酮、BHT和TBHQ对4种氧化反应的半抑制浓度Tab.2 The IC50value of the total flavonoids fromTree pe ony bark，BHT and TBHQ to four oxidation reactions

从表2 可看出，同种物质对于不同氧化反应的抑制效果、以及不同物质对于同种氧化反应的抑制效果的规律与2.2.1相同。

3 结论

以常用的化学抗氧化剂BHT和TBHQ为对照，测试了丹皮总黄酮对·OH、、·DPPH的清除能力以及对小鼠肝组织脂质过氧化的抑制作用，并以此来评价丹皮总黄酮的体外抗氧化能力。结果表明，丹皮总黄酮对·OH清除率＞对·DPPH清除率＞对清除率＞对小鼠肝组织脂质过氧化抑制率；丹皮总黄酮具有较强的抗氧化能力；其抗氧化活性略低于或等于TBHQ的抗氧化活性，且远远大于BHT的抗氧化活性，在较低浓度下即对多种氧化反应具有抑制作用。表明，丹皮总黄酮是一种很有发展前景的天然抗氧化剂。

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