离子液体双水相萃取山楂黄酮和多糖的研究

巩育军，牛盛童，黄学锋，王 键

（广东石油化工学院，广东 茂名525000）

离子液体双水相体系（ionic liquid aqueous twophase system，ILATPS）一般是由亲水性离子液体、无机盐（如磷酸盐、碳酸盐、氢氧化物等）和水形成的双水相体系，综合了离子液体和双水相体系的优点[1］。作为一种高效的新型绿色分离体系，与传统聚合物双水相体系相比，具有黏度低、不挥发、对水和空气稳定、分相时间短、易回收利用等优点，备受研究者的关注[2－6］。山楂为蔷薇科（Rosaceae）植物山楂（Crataegus pinnatifida）、山 里 红 （Crataegus pinnatifida var.major）及野山楂（Crataegrus cuneata）的干燥成熟果实，其有效成分为有机酸类、三帖类、黄酮类和多糖等[7］。研究表明山楂对治疗肉食积滞、心腹刺痛、高血压以及调节人体免疫力有显著的功效[8］。有关山楂中有效成分的提取报道较多，均以单一成分为主，如用乙醇 提 取 总 黄 酮[9－10］、用 水 提 取 山 楂 多 糖[11－12］等。 作者以[Bmim］BF4／（NH4）2SO4双水相为萃取体系，同时提取山楂中的黄酮和多糖，考察了离子液体浓度、（NH4）2SO4浓度、山楂用量、超声时间等因素对萃取率的影响，为山楂总黄酮类和多糖的提取提供了新的方法。

1 实验

1.1 试剂与仪器

1－丁基－3－甲基咪唑四氟硼酸盐[Bmim］BF4、硫酸铵、硝酸铝、亚硝酸钠、苯酚、甲醇等均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

芦丁标准品、葡萄糖标准品，中国药品生物制品检定所；干燥山楂片，茂名大森林药店。

722N型紫外可见分光光度计，上海第三分析仪器厂；KQ－32000DB型数控超声波仪，昆山超声仪器有限公司；80－1型离心沉淀机，巩义英峪予华仪器厂；HH－601型超级恒温水浴，江苏金坛康华电子仪器制造厂。

1.2 山楂样品的处理

干燥山楂片→粉碎→过60目筛→用石油醚在索氏提取器中回流4h脱脂→收集残渣→烘干→粉碎→山楂样品。

1.3 黄酮含量的测定

采用 NaNO2－Al（NO3）3－NaOH 方 法 测 黄 酮 含量[7，13］。在NaNO2存在下的碱性水溶液中，黄酮母核上的游离羟基和羰基可与铝离子试剂反应产生红橙色络合物。以芦丁为标准对照品，用紫外可见分光光度计在512nm处测定其吸光度，根据标准曲线确定其含量。实验测得标准曲线的拟合线性回归方程为：A＝0.01175c－0.00404，相关系数R2＝0.9985。

1.4 多糖含量的测定

利用苯酚－硫酸法测多糖含量[7，14］。多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，再迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。以葡萄糖为标准对照品，用紫外可见分光光度计在490nm下测其吸光度，根据标准曲线确定其含量。实验测得标准曲线的拟合线性回归方程为：A＝0.00485c＋0.09347，R2＝0.9987。

1.5 [Bmim］BF4／（NH4）2SO4 双水相体系的配制及萃取方法

离子液体双水相体系在恒温25℃环境中配制，体系总体积为5mL。在10mL具塞比色管中加入山楂样品和一定比例的[Bmim］BF4和（NH4）2SO4，加二次蒸馏水至5mL，摇匀后置于超声仪中超声（40kHz）萃取数分钟，然后以2 500r·min－1离心20min后静置，待分相完全、界面稳定后，记录双水相上、下相体积，用微型刻度针管分别抽取一定量的上、下相溶液，按1.3、1.4中的方法测定吸光度，计算上、下相中山楂黄酮、多糖的浓度，按下式计算萃取率。

式中：、分别为山楂黄酮、多糖的萃取率；V1、V2分别为上、下相的体积，mL；c1、c2为上、下相中黄酮、多糖的浓度，μg·mL－1。

2 结果与讨论

2.1 离子液体浓度对萃取率的影响

在恒定温度25℃下，固定（NH4）2SO4的浓度为0.08g·mL－1、山楂用量为0.05g、加水至5mL、超声时间为15min，考察离子液体[Bmim］BF4浓度对山楂黄酮、多糖萃取率的影响，结果见图1。

图1 离子液体浓度对山楂黄酮、多糖萃取率的影响Fig.1 Effets of concentration of ionic liguid on the extraction rate of hawthorn flavonoids and polysaccharide

由图1可知，随着离子液体浓度的增大，黄酮萃取率不断增大，而多糖萃取率不断减小。山楂黄酮属于多酚类有机化合物，由于疏水作用，其较多分配在以离子液体胶束[15］为基本结构的双水相上相中，因此，[Bmim］BF4浓度越高，上相中离子液体胶束浓度越大，疏水性越强，双水相上相体积也就越大，更有利于黄酮萃取；而山楂多糖中的水溶性生物大分子多糖，由于含有大量羟基等极性基团，亲水作用明显，故较多分配在富含水盐的双水相下相。实验发现，随着[Bmim］BF4浓度的增大，下相体积显著减小，故多糖萃取率明显减小。

考虑到离子液体多时会出现盐不完全溶解[15］以及萃取成本增加，故确定萃取体系中适宜的[Bmim］BF4浓度为0.26～0.30g·mL－1。

2.2 （NH4）2SO4 浓度对萃取率的影响

在恒定温度25℃下，固定离子液体[Bmim］BF4浓度为0.30g·mL－1、山楂用量为0.05g、加水至5 mL、超声时间为15min，考察无机盐（NH4）2SO4浓度对山楂黄酮、多糖萃取率的影响，结果见图2。

图2 （NH4）2SO4浓度对山楂黄酮、多糖萃取率的影响Fig.2 Effects of concentration of ammonium sulfate on the extraction rate of hawthorn flavonoids and polysaccharide

由图2可知，随着（NH4）2SO4浓度的增大，黄酮萃取率不断减小，而多糖萃取率不断增大。这和2.1的规律恰好相反。这可能是因为，（NH4）2SO4与离子液体竞争夺取水分子[15］，使双水相的上相体积减小，尽管黄酮的上相浓度波动不大，但其萃取率仍然明显减小。与此相反，由于下相体积增大，尽管山楂多糖的下相浓度变化也不大，山楂多糖萃取率仍然明显增大。

实验表明，无机盐（NH4）2SO4的非特征性盐析作用[15］是形成离子液体双水相体系的决定因素，（NH4）2SO4浓度太大或太小都会影响双水相分相。综合黄酮和多糖的萃取率变化，确定萃取体系中适宜的（NH4）2SO4浓度为0.08～0.10g·mL－1。

2.3 山楂用量对萃取率的影响

在恒定温度25℃下，固定离子液体[Bmim］BF4浓度为0.30g·mL－1、（NH4）2SO4浓度为0.08g·mL－1、加水至5mL、超声时间为15min，考察山楂用量对山楂黄酮、多糖萃取率的影响，结果见图3。

图3 山楂用量对山楂黄酮、多糖萃取率的影响Fig.3 Effects of hawthorn dosage on the extraction rate of hawthorn flavonoids and polysaccharide

由图3可知，在山楂用量低于0.15g区间内，随着山楂用量的增加，双水相萃取黄酮和多糖的萃取率均不断增大；但当山楂用量超过0.15g之后，两者均有所减小。实验发现，山楂用量的改变，对上下相的体积基本没有影响，但溶出的黄酮和多糖的量增加，故萃取率增大。实验还发现，当山楂用量超过0.25g时，会出现双水相相界面不清晰的现象，可能是由于双水相体系已达最大萃取容量，这与文献[4，16］的相关结论类似。故确定适宜的山楂用量为0.14～0.17g。

2.4 超声时间对萃取率的影响

在恒定温度25℃下，固定离子液体[Bmim］BF4浓度为0.30g·mL－1、（NH4）2SO4浓度为0.08g·mL－1、山楂用量为0.05g、加水至5mL，考察超声时间对山楂黄酮、多糖萃取率的影响，结果见图4。

由图4可知，在超声萃取初期，随着超声时间的延长，山楂黄酮和多糖的萃取率均有所增大，但对于黄酮，15min后萃取率增幅已不明显；对于多糖，20min后萃取率反而有所减小。

超声对萃取最主要的强化作用在于空化效应、热效应和机械效应[17］。超声波产生的高速射流和剧烈湍动，促进植物组织细胞变形破碎以及有效成分的迅速溶出，大大加快相相间的传质速度，提高萃取效率。故在有效成分未能达到最大溶出之前，超声时间的延长将促使萃取率增大，但达到某一阈值之后，萃取率将不再增大。多糖超声20min后萃取率减小可能与超声时间过长导致体系温度升高，较明显地改变了其分配系数有关。故确定适宜的超声时间为15～20min。

3 结论

用分光光度法研究了山楂黄酮和多糖在[Bmim］BF4／（NH4）2SO4双水相体系中的萃取行为，考察了离子液体[Bmim］BF4浓度、（NH4）2SO4浓度、山楂用量、超声时间等因素对萃取率的影响。确定最佳萃取条件为：离子液体[Bmim］BF4浓度0.26～0.30g·mL－1、（NH4）2SO4浓度0.08～0.10g·mL－1、山楂用量0.14～0.17g、超声时间15～20min，在此优化条件下，双水相上相黄酮的萃取率为86.4%～96.0%，双水相下相多糖的萃取率为75.2%～76.0%。[Bmim］BF4／（NH4）2SO4双水相体系萃取山楂黄酮、多糖效果良好，后续将进一步考察离子液体的回收和循环使用方法，以降低成本。

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