接种荧光标记根瘤菌对苜蓿幼苗生长的影响

陈力玉　张淑卿　李剑峰　等

摘要：将含有cfp（cyan fluorescent protein）基因质粒的荧光标记根瘤菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28，S.12531cfp2、S.12531cfp13、S.12531cfp26、S.LH3436cfp1、S.LH3436cfp2、S.LH3436cfp6接种于甘农5号紫花苜蓿，测定苜蓿幼苗生物量、单株结瘤数、固氮酶活性等，结果表明：荧光标记根瘤菌可有效促进植株生长和生物量的积累，有明显促生效果；与出发菌相比，荧光标记根瘤菌未对苜蓿幼苗产生显著的不良影响，能在植物体内稳定表达，具有与出发菌株相近的促生能力。

关键词：根瘤菌；接种；苜蓿幼苗；生物量；固氮酶活性

中图分类号：S 154.37；S 54文献标识码：A文章编号：10095500（2013）06000108

固氮效率由根瘤菌和豆科植物双方的基因所控制，豆科植物相关基因与根瘤菌相关基因的相容性决定了根瘤菌侵染豆科植物的有效性[1]。接种根瘤菌释放至田间后，必然要与土著根瘤菌及种子内生根瘤菌[2]在土壤营养、生活空间及宿主植物等方面进行竞争，接种根瘤菌能否正常结瘤直接取决于其竞争力的大小。

目前，对于cfp基因用于苜蓿根瘤菌的研究较少，为检测cfp基因标记后的根瘤菌能否侵染植物根系并结瘤，将含有cfp基因的质粒的荧光标记根瘤菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28，S.12531cfp2、S.12531cfp13、S.12531cfp26、S.LH3436cfp1、S.LH3436cfp2、S.LH3436cfp6接种于甘农5号紫花苜蓿（Medicago sativa cv.Gannong No.5），以不接种的处理为对照，观察导入的cfp基因在植物体内能否正常表达，比较出发菌S.LZgn5、S.12531和S.LH3436及其cfp荧光标记菌对苜蓿幼苗的影响。

1材料和方法

1.1供试种子

甘农5号紫花苜蓿种子，由草业生态系统教育部重点实验室提供。

试验培养基为TY培养基[3]，酵母甘露醇液体培养基[4]和Hoagland无氮营养液[5]。

1.2菌株

出发菌S.LZgn5及其荧光标记菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28，出发菌S.12531及其荧光标记菌S.12531cfp2、S.12531cfp13、S.12531cfp26。

出发菌S.LH3436及其荧光标记菌S.LH3436cfp1、S.LH3436cfp2、S.LH3436cfp6。

1.3试验方法

1.3.1种子表面灭菌

取适量甘农5号紫花苜蓿种子，置于已灭菌的三角瓶，用无菌水洗涤2次，加入75%的乙醇浸泡3 min，无菌水清洗4次，每次2 min，0.1%的HgCl2浸泡3 min，无菌水清洗4次，每次2 min。将表面灭菌的种子置于YMA培养基，观察是否有菌长出，检测表面灭菌是否彻底。

1.3.2苜蓿种子的发芽处理

将培养皿和滤纸121 ℃灭菌26 min，然后在无菌培养皿中放入双层无菌滤纸[6]，将表面灭菌的甘农5号紫花苜蓿种子均匀置于

1.3.3制备菌液及接种

将苜蓿根瘤菌及其荧光标记菌，分别转接到装有100 mLYMA液体培养基的三角瓶，将三角瓶置于摇床，28 ℃，120 rmin培养至在OD600 nm的吸光度达到0.5～0.8。

1.4测定指标和方法

1.4.1生长指标的测定

在苜蓿苗生长的第46 d，将苜蓿苗和河砂从杯中整体取出，用水冲洗，至苜蓿苗根系完全冲洗干净，在水中将苜蓿苗根系分开，尽量保持根的完整性，用滤纸吸干植株表面水分。

（1）测量苜蓿苗的株高及根长。

（2）对各处理的叶片数进行计数。

（3）选取植株自上而下倒数第2个分枝中间的叶片，采用描形称重法[8]测定叶片的叶面积，每处理3次重复。

（4）称量地上鲜重、根鲜重，每处理3次重复，称鲜重后置于烘箱中，105 ℃处理20 min，80 ℃连续烘干12 h后称其干重。

1.4.2固氮能力测定

（1）单株结瘤数采用苜蓿苗根瘤计数。

（2）根瘤等级的划分[9]采用5分制：1分根瘤为中空无内容物的死亡根瘤；2分根瘤为切面灰白色的无效根瘤；3分根瘤切面略呈粉红色，但直径小于<0.5 mm；4分根瘤切面呈粉红色，1 mm>直径≥0.5 mm；5分根瘤切面呈粉红色，直径≥1 mm。

（3）根瘤固氮酶活性的测定：各回接植株根瘤的固氮酶活性采用乙炔还原法[10]。在根瘤两端根系0.5 cm处，将根瘤切下，称其鲜重0.1 g，置于盛有湿润滤纸片的17 mL西林瓶中，盖紧瓶塞，并以保鲜膜密封，每处理3次重复，以2 mL的无菌注射器抽出1.7 mL的瓶内空气，再注入1.7 mL乙炔气体，其终浓度为10%。室温下反应1 h后，以100 μL进样器抽取西林瓶内气体50 μL，用GC7890F气相色谱仪测定各处理在1 h内生成的乙烯气体含量（μmol），计算植株根瘤的固氮酶活性，（μmolh·g）[11]。

（4）荧光标记菌占瘤率的检测选取各处理植株生长良好的根瘤，从根瘤两端根系0.5 cm处将根瘤切下[12]，各称取0.01 g，用无菌水冲洗2次，再以75%的乙醇处理5～10 s，破除表面张力，去除组织上的气泡，无菌水冲洗4次；以碘伏浸泡2 min，用无菌水冲洗干净；将根瘤转移至无菌研钵中，加入4 mL无菌水研磨充分后转移至5 mL无菌离心管中，5 000 rmin离心5 min；再吸取0.2 mL上清液涂抹于TY平板，每处理3次重复，待菌落长出后，以手提式紫外灯（OD336 nm）照射，计数并拍照。

1.4.3叶绿素含量测定[13]

取各处理长势相似植株至上而下第二个分枝的苜蓿叶片，各称取0.1 g剪碎，测定叶绿素含量。

以Excel 2003软件进行数据整理，用IBM16.0 SPSS分析软件以Duncan法进行数据分析。

2结果与分析

2.1荧光标记菌及其出发菌株对苜蓿幼苗生物量的影响

生物量的大小反映了植株积累物质能力的强弱，接种的苜蓿幼苗的根鲜重和干重、地上部分鲜重和干重均高于未接种的处理。其中，进行S.LZgn5，S.LZgn5cfp6，S.LZgn5cfp16和S.LZgn5cfp28接种的苜蓿幼苗的根鲜重高出对照163.8%～208.4%，根干重高出对照167.9%～225.9%，地上鲜重高出对照76.4%～107.2%，地上干重高出对照88.9%～99.7%，均与对照差异显著（P<0.05），表明S.LZgn5及其荧光标记菌具有一定的促生作用。

S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28接种后苜蓿幼苗的根鲜重、根干重、地上鲜重和干重分别比出发菌S.LZgn5高出3.2%～16.9%、4.6%～21.6%、3.2%～17.5%和2.4%～5.7%，但差异均不显著（P<0.05），说明S.LZgn5的荧光标记菌的接种并没有影响苜蓿幼苗生物量的积累，而是促进了生物量的增加，以S.LZgn5cfp6表现较好。

S.12531及其荧光标记菌的接种提高了苜蓿幼苗生物量；其中，根鲜重、根干重、地上鲜重和干重

2.2荧光标记菌及其出发菌株对苜蓿幼苗根长、株高等的影响

2.3荧光标记菌及其出发菌株对苜蓿幼苗固氮能力的影响

苜蓿根瘤的固氮酶活性大小反映了根瘤中根瘤菌固定氮素能力的强弱，能否在原寄主上形成有效根瘤是确认根瘤菌是否有效的基本方法。S.LZgn5及其荧光标记菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28接种的苜蓿幼苗的单株结瘤数、根瘤固氮酶活性和根瘤等级均与对照存在显著差异（P<0.05），其中，固氮酶活性是对照的12.4～14.4倍，可见，根瘤菌S.LZgn5及其荧光标记菌的接种提高了根瘤的固氮酶活性，S.LZgn5cfp6较好。

S.LZgn5cfp6，S.LZgn5cfp16和S.LZgn5cfp28接种的苜蓿幼苗的单株结瘤数、固氮酶活性及根瘤等级比出发菌S.LZgn5高出15.7%，5.1%和6.2%，无显著差异（P>0.05）；荧光标记菌的占瘤率与50%相比，无显著差异，说明荧光标记菌具有一定的与种子内生根瘤菌竞争的能力。

2.4荧光标记菌及其出发菌株对苜蓿幼苗叶绿素含量的影响

叶绿素含量的高低反应了植物光合作用的强弱，也间接体现了植株利用氮素能力的强弱。S.LZgn5及其荧光标记菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28接种的苜蓿幼苗的叶片叶绿素含量比对照高出52.3%～67.1%（图1），差异显著（P<0.05），各荧光标记根瘤菌与出发菌相比，无显著差异。

S.12531及其荧光标记菌S.12531cfp2、S.12531cfp13、S.12531cfp26接种的苜蓿幼苗的叶片叶绿素含量比对照高出57.7%～63.7%（图2），差异显著（P<0.05），而各荧光标记根瘤菌与出发菌相比，无显著差异。

3讨论

根瘤菌为微好氧[15]的革兰氏阴性杆状细菌，能与植物共生，固定氮素供给宿主营养。有研究表明，根瘤菌的接种可显著提高植物产量。目前，美国有80%的苜蓿在播种之前进行根瘤菌接种，加拿大和澳大利亚几乎所有苜蓿在播种之前都要进行根瘤菌接种，我国从1981年开始进行苜蓿根瘤菌优良菌株的筛选。研究中，各出发菌与其荧光标记菌接种苜蓿幼苗的地上鲜重和干重、根鲜重和干重、根长、株高和固氮酶活性等均显著（P<0.05）高于未接种的处理，说明出发菌与其荧光标记菌均具有明显的促生作用，且荧光标记根瘤菌不会对苜蓿幼苗的根系产生影响。

试验中，无菌环境下表面消毒的苜蓿种子仍可结瘤，且各荧光标记菌接种于苜蓿幼苗后，占瘤率并未达到100%，说明在荧光标记菌接种的苜蓿幼苗根瘤中有其他根瘤菌的存在，这也印证了张淑卿的推论[2]，即苜蓿种子内部携带有根瘤菌，同时在苜蓿种子发芽过程中，种皮吸水膨胀，其携带的根瘤菌随种皮浸出液分布于胚根根际的土壤，完成种子内生根瘤菌的接种；荧光质粒的复制需借助于根瘤菌细胞产生的能量，而根瘤菌侵染植株根系和结瘤固氮又是高耗能的生理过程，因此，根瘤菌细胞和其荧光质粒间正常和谐的运作是荧光标记根瘤菌能否成功侵染根系的重要方面，在进入植株根系后，荧光标记根瘤菌必然要与种带根瘤菌竞争生存空间和养分供给，能否在植株根系形成有效根瘤决定于竞争结瘤能力的大小[16，17]。

试验研究中，在各荧光标记根瘤菌回接的苜蓿幼苗的根瘤中，均检测出荧光标记根瘤菌，S.LZgn5和S.LH3436的荧光标记根瘤菌的占瘤率与50%相比无显著差异，说明荧光标记根瘤菌的竞争结瘤能力与种子内生根瘤菌相当，荧光质粒的导入没有显著影响根瘤菌的竞争结瘤能力；S.12531的荧光标记根瘤菌的占瘤率均高于50%，与50%相比[14]差异显著（P<0.05），说明各荧光标记根瘤菌均能成功侵染和结瘤，表明荧光质粒的导入并未对菌株的侵染和结瘤能力有显著的负面影响。

导入外源质粒的标记菌对宿主的侵染结瘤及促生能力与菌种自身的性质、宿主植物的种类与质粒类型相关[19，20]。李杰[18]等运用三亲本杂交法将带有luxAB和parCBA基因的重组质粒pHN208导入到6株大豆根瘤菌中，通过接种试验证明PHN208的导入并不影响根瘤菌的竞争结瘤能力。本研究通过S.LZgn5、S.LH3436和S.12531的荧光标记根瘤菌的接种试验，测定接种苜蓿幼苗的生物量、固氮能力指标和叶片叶绿素含量等指标，结果显示外源质粒的导入未影响标记菌的竞争结瘤能力。

4结论

4.1荧光标记菌根瘤菌的促生作用

S.LZgn5，S.12531和S.LH3436及其荧光标记菌根瘤菌接种苜蓿幼苗的根鲜重和干重、地上部分鲜重和干重、根瘤固氮酶活性、根长、株高和叶绿素含量等均显著（P<0.05）高于未接种的处理。这说明接种本研究涉及的含荧光质粒的根瘤菌可有效促进植株的生长和生物量的积累，具有明显的促生效果。

4.2荧光标记根瘤菌与出发菌接种效果的比较

（1）各荧光标记根瘤菌接种苜蓿幼苗的根鲜重和干重、地上部分鲜重和干重、株高和根长等与对应的出发菌相比，无显著差异。表明荧光质粒的导入没有影响菌株对苜蓿幼苗生物量积累的促进效果。

（2）在固氮能力指标中，各荧光标记根瘤菌与其对应的出发菌在接种的苜蓿幼苗的单株结瘤数、根瘤固氮酶活性、根瘤等级评分和占瘤率方面的表现有差异。

S.12531cfp13接种苜蓿幼苗的根瘤固氮酶活性比S.12531高出42.9%，差异显著（P<0.05）；且各荧光标记根瘤菌的占瘤率均高于50%，差异显著（P<0.05）。

S.LH3436cfp1、S.LH3436cfp2、S.LH3436cfp6接种的苜蓿幼苗的根瘤数均低于出发菌株S.LH3436，差异显著（P<0.05），S.LH3436cfp6接种的苜蓿幼苗的根瘤固氮酶活性和根瘤等级评分要高于出发菌S.LH3436，差异显著（P<0.05）。

参考文献：

[1]Tan G Y.Genetic variation for acetylene reduction rate and other character in alfalfa[J].Crop Science，1981，21：485-488.

[2]张虎天，郭丽琢，柴强，等.接种根瘤菌对豌豆玉米体系根际细菌数量及氮营养的影响[J].甘肃农业大学学报，2011，46（1）：30-33.

[3]张忠明，陈华癸，李阜棣，等.紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒pRaZ15的分离[J].生物工程学报，1991，7（3）：213-219.

[4]殷爱华，韩素芬.豆科树种凝集素和根瘤菌胞外多糖结合反应与结瘤的关系[J].南京林业大学学报（自然科学版），2005，29（5）：88-90.

[5]Hoagland D，Arnon D I.The water culture method for growing plants without soil[J].California Agricultural Experiment Station Bulletin，1938（1）：1-39.

[6]Vertucci C W，Roosee，Crane J.The oretical basis of protocols foe seed storage optimummoisture contents for pea seeds stored at different temperatures[J].Annalsof Botany，1994，74：531-540.

[7]Shi D C，Zhao K F.Effects of sodium chloride and carbonate on growth of puccinellia tunuiflora and on present state of mineral elements in nutrient solution[J].Acta Pratacult，1997，6：51-61.

[8]谭一波.叶面积指数的主要测定方法[J].林业调查规划，2008，33（3）：47-49.

[9]李剑峰，师尚礼，张淑卿.环境酸度对紫花苜蓿早期生长和生理的影响[J].草业学报，2010，19（2）：47-54.

[10]HaraS，HashidokoY，DesyatkinR V，et al.High rate of N2 fixation by east Siberian cryophilic soil bacteria as determined by measuring acetylene reduction in nitrogen poor medium solidified with gellan gum [J].Applied and Environmental Microbiology，2009，75：2811-2819.

[11]谭志远，彭桂香，徐培智，等.普通野生稻（Oryza rufipogen）内生固氮菌多样性及高固氮酶活性[J].科学通报，2009，54：1885-1893.

[12]Somasegaran P，Hoben H J.Methods in legumerhizobium technology [M].1985：7-29

[13]邹琦.植物生理生化实验指导[M].北京：中国农业出版社，1995.

[14]凌瑶，张小平，周俊初，等.用荧光酶基因（cfp）标记法研究菜豆根瘤菌的竞争性和有效性[J].中国土壤与肥料，2008（1）：73-77.

[15]霍尔特（著）.刘复今（译）.伯杰鉴定手册[M]（第八版）.济南：山东大学出版社，1988：93- 94.

[16]陈翠翠，马元武，冯永君，等.MADSbox家族蛋白在植物开花、结实及根瘤形成中的多功能调节作用[J].华北农学报，2008，23（2）：80-83.

[17]Dudeja S S.Persistence of Dradyrhizobium S P.（caianus） in a sandy loam[J].Soil Boil Biochem，1989，21（5）：709-713.

[18]李杰，陈丽华，李希臣.一种应用luxAB基因标记大豆根瘤菌的新方法[J].大豆科学，2003，22（3）：172-175.

[19]李友国，周俊初.导入dctABD和nifA基因对费氏中华根瘤菌共生固氮的影响研究[J].遗传学报，2002，29（2）：181-188.

[20]朱光富，周俊初，陈华癸.外源质粒（基因）导入花生根瘤菌的行为分析[J].遗传学报，1996，23（2）：131-141.