干扰素α对肝癌细胞中转录因子Sp1的表达及活性的影响

潘奇 陈万勇 朱凯 张巨波 赵一鸣 朱小东 孙惠川 王鲁 任宁

(复旦大学附属中山医院肝外科，上海 200032)

在肿瘤病死原因中，原发性肝癌已居世界第3位、中国第2位［1-2］。前期的动物研究［3］发现，干扰素α可显著地抑制肝癌的生长、转移和复发;之后的临床随机对照试验［4］也证实干扰素α可以减少和推迟肝癌切除术后的复发转移，但具体的调控机制仍不清楚。转录因子Sp1(specificity protein 1)是序列特异性的DNA结合蛋白，参与调控多种基因的转录［5］。近年来研究［6-7］发现，Sp1 在肿瘤组织中有异常表达和活化。本研究采用蛋白免疫印迹(Western blotting，WB)法和凝胶电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)法研究干扰素α对肝癌细胞内Sp1的表达及活性的影响，以探讨干扰素α治疗肝癌的可能机制。

1 资料与方法

1.1 细胞株 人肝癌细胞系MHCC97H由复旦大学肝癌研究所保存和培养。

1.2 主要试剂 高糖DMEM培养液(美国Gibco-BRL公司)，特级胎牛血清(40 nm过滤，美国Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA 消化液(美国Difco公司)。干扰素α1b(深圳科兴生物工程有限公司);细胞总蛋白和核蛋白抽提试剂盒(美国Panomics公司);蛋白浓度检测试剂盒(Bradford法，上海申能博彩生物科技有限公司);EMSA combo试剂盒(美国Panomics公司);Western blotting试剂盒(美国 Millipore公司);大鼠抗人 Sp1(PEP2，sc59)多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);大鼠抗人磷酸化Sp1(Thr739)多克隆抗体(美国Centre Antoine公司);辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠IgG(上海康成生物工程有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养及药物干预、细胞总蛋白及核蛋白抽提 MHCC97H细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱内传代培养，每隔3～5 d传代1次。将对数生长期的MHCC97H细胞分为5组，各组细胞分别用不含干扰素的10%胎牛血清的DMEM培养液及分别含干扰素5、10、30、50 ng/mL的无血清 DMEM 培养液继续培养20 min，进行后续实验。按照试剂盒说明抽提细胞总蛋白及核蛋白，采用Bradford法测定蛋白浓度。

1.3.2 EMSA法检测干扰素α对Sp1活性的影响凝胶寡核苷酸探针(生物素标记)序列如下:Sp1上游引物:5'-ATTCGATCGGGGCGGGGCGAGC-3';下游引物:5'-GCTCGCCCCGCCCCGATCGAT-3'。参照EMSA combo试剂盒说明进行操作，将细胞核蛋白抽提物(5μg)与生物素标记的凝胶寡核苷酸探针(10 ng)在20℃条件下反应30 min，反应混合物经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶在0.5Tris-硼酸电泳缓冲液中电泳3 h(温度4℃，电压120V)。用半干电转移法转移于尼龙膜上。用GEA封闭液室温下封闭尼龙膜40 min后加入用缓冲液稀释的碱性磷酸酶耦联的链亲和素，室温震摇10 min，加化学发光底物后室温孵育2 min，在暗室中曝光于X线胶片。

1.3.3 Western blotting法检测 Sp1的表达及磷酸化程度 取20 mL总蛋白经12% 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用 5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入Sp1一抗，4℃孵育过夜，次日用洗膜缓冲液TBST洗膜后加入荧光标记的二抗(1∶10 000稀释)，室温孵育1 h。

2 结 果

2.1 干扰素α对Sp1活性的影响 干扰素α可明显下调MHCC97H细胞中Sp1的活性，并呈剂量依赖性。见图1。

2.2 干扰素α对Sp1蛋白含量和磷酸化水平的影响 干扰素α下调MHCC97H细胞中Sp1蛋白的表达及磷酸化水平，并呈剂量依赖性。见图2。

图1 干扰素α对MHCC97H细胞中Sp1活性的影响

图2 干扰素α对MHCC97H细胞中Sp1蛋白表达及磷酸化水平的影响

3 讨 论

肝癌根治术后5年的转移复发率为60%～70%［2］。干扰素α能降低肝癌患者的术后复发转移率，提高患者的总生存率［4］，对其他肿瘤也有类似效果［8-9］，但干扰素降低肿瘤复发转移的作用机制，目前尚不明了。

一般认为，Sp1可能参与肿瘤发展、增殖和转移。目前对Sp1的相关研究多集中在蛋白或基因水平。Yao等［5］发现，Sp1在胃癌细胞核内呈高表达，在正常胃黏膜细胞呈低表达或无表达。Shi等［6］发现，胰腺癌中Sp1异常活化，可导致血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等下游基因过表达，增强肿瘤血管的生成效应，从而促进肿瘤的侵袭和远处转移。

本研究采用EMSA法检测干扰素α对Sp1活性的影响，结果显示，干扰素α能明显降低Sp1的活性，并呈剂量依赖性。此外，Sp1的转录调控活性还受蛋白翻译后修饰(如磷酸化、糖基化)等的调控［10-12］。本研究采用Western blotting法检测干扰素α对Sp1蛋白表达和磷酸化水平的影响，结果显示，干扰素α明显下调Sp1在肝癌细胞MHCC97H细胞核内的含量和磷酸化程度，并呈剂量依赖性，以Sp1蛋白磷酸化水平下调更为明显。

研究［13］证实，干扰素抗肝癌的主要机制是抑制肝癌的血管生成，进而抑制肝癌的复发转移;而Sp1与VEGF启动子特异性结合是VEGF转录调控最重要的机制［14］;本研究发现，干扰素可调节Sp1的活性、表达及磷酸化程度。由此判断，Sp1可用于预测干扰素α抗肝癌的临床疗效。

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