雌激素对大鼠脑缺血再灌注后血脑屏障作用研究

侯进义，沈 霞，孙菊光 (徐州市中医院神经内科，江苏徐州 221000)

脑缺血后组织损伤涉及多方面的机制，如细胞凋亡、缺血区局部脑血流的减少、毛细血管通透性增加、自由基的形成、p淀粉样蛋白的神经毒性、钙离子超载及神经兴奋毒效应等多种因素，所有这些反应的中心都是微血管，所以对于血脑屏障在脑缺血中作用的研究就显得越来越重要。紧密连接(TJ)是保持BBB完整性的重要因素［1］。1993 年，Furuse等［2］分离出第一个TJ跨膜蛋白，称为Occludin。大量研究表明，缺血性中风存在BBB的损伤，并影响Occludin等BBB相关蛋白的表达［3-4］。随着对雌激素治疗缺血性脑血管病基础研究的进一步深入，发现雌激素对缺血后神经元及内皮细胞均有保护作用。能够在缺血级联反应中对抗各种炎症因子的损害，减轻大鼠脑缺血再灌注引起的皮层损伤，拮抗大鼠脑缺血后的神经细胞凋亡，改善缺血区神经元的能量代谢和蛋白合成，在多环节多靶点发挥作用［5-6］。本实验在前人研究的基础上，探讨雌激素对大鼠脑缺血再灌注后BBB的通透性、occludin的影响，进一步探讨雌激素在脑缺血中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雌性清洁级 SD大鼠，鼠龄3个月，体质量240～300 g，由徐州医学院动物实验中心提供;动物自由饮食，室温22℃，昼夜节律下饲养;一抗(occludin兔源性多克隆抗体)购自Santa Cruz公司，二抗(抗兔IgG/AP)购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 去卵巢手术 测定大鼠体质量并记录，手术切除大鼠双侧卵巢后单笼放置。术后禁水2 h，禁食4 h。手术后10 d大鼠进入实验。

1.2.2 大脑中动脉闭塞(MCAO)局灶性脑缺血－再灌注模型动物室温饲养，室内采光、通风。实验前24 h禁食、2 h禁水。采用 Longa线栓改良法［7］建立大鼠右侧大脑中动脉缺血(MCAO)模型。

1.2.3 分组及给药 健康雌性去势SD大鼠139只随机分为3组，即假手术组、模型组、雌激素预处理组，每组又分为再灌4 h、24 h、3 d亚组。BBB通透性和脑组织含水量的检测:每亚组取6只大鼠;电镜观察:取模型组、雌激素预处理组24 h、3 d亚组，每亚组取2只大鼠;免疫印迹检测:每亚组取3只大鼠。雌激素预处理组于术前30 min肌肉注射苯甲酸雌二醇(1 mg/kg)，假手术组、模型组于术前肌肉注射生理盐水。

1.2.4 实验方法及检测指标 神经功能缺损依据Longa的5分制评分标准进行评分。取EB混合甲酰胺，共做7管，其浓度分别为 8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 ug/mL，60 ℃ 避光水浴24 h，于紫外分光光度仪上(波长632 nm)进行比色，蒸馏水作空白对照，制作出标准曲线［8］。脑缺血再灌注后各时间点前1 h将动物麻醉，经左侧股静脉注射2%EB生理盐水(2 mL/kg)，可见注入后大鼠四肢末端很快变蓝，1 h后断头取脑。取脑前行生理盐水心脏灌注，直至右心耳流出清亮液体，以减少血管残留部分EB的影响。然后迅速取右半球缺血区脑组织和左侧对应区域脑组织，称取湿重后置于等量体积甲酰胺(1 mL/100 mg)的试管中，放入60℃恒温水浴箱，加盖遮光水浴24 h，然后1 000 r/min离心5 min，取上清液，置可见分光光度计(波长632 nm)测光密度(optical density，OD)值，以蒸馏水作空白比色。根据标准曲线求得EB含量(μg/mL湿重)。

1.2.5 脑组织含水量 大鼠处死后，取大鼠右侧缺血区及对侧大脑称湿重，置90℃恒温干燥箱内，干燥72 h，称其干重，按Elltot公式计算脑含水量:脑组织含水量(%)=100×(湿重一干重)/湿重。

1.2.6 BBB的超微结构 大鼠处死后，取右侧大脑额顶叶脑皮质组织，大小为1 mm×1 mm×1 mm，立即放入2.5%戊二醛中固定24 h，1%的四氧化锇后固定，乙醇逐级脱水，Epon618环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀－柠檬酸铅染色，透射电镜观察并摄像。

1.2.7 Occludin 蛋白的 Western blot分析 将样品置于0.5 mL匀浆液中，于机械粉碎机下将组织粉碎，操作过程在冰上进行。离心，1 000转，4℃，15 min，取上清液放于新的Eppendorf管中。取 20 ul蛋白样品加人380 ul Folin甲溶液中30℃水浴15 min，加入Folin乙溶液中混匀30℃水浴30 min，标准BSA试剂做空白对照。在波长650 nm处进行比色测OD值，用标准蛋白浓度曲线进行定量。Western blot分析;将蛋白样品用匀浆液调成相同浓度，加入相同体积上样缓冲液，沸水煮5 min进行蛋白变性。取100 ug总蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶100 v分离胶200 v，65 min。电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，电流40 mA，共计1 h。将膜用脱脂奶粉封闭1 h，加入兔源性多克隆occludin抗体(1∶400稀释)，4℃，过夜。washing buffer洗5 min，3次。加人碱性磷酸酶标记的兔抗IgG 抗体(1∶1 000稀释)，室温，2 h，washing buffer洗 5 min，3次，加人NBT/BCIP显色液显色，约15 min，用蒸馏水终止反应。结果通过天能图像分析系统进行分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 雌激素对脑缺血大鼠BBB通透性的影响

与假手术组比较，局灶性脑缺血4 h，模型组大鼠脑组织EB含量增加(P＜0.05)，随缺血时间延长，脑组织EB含量持续增加，至24 h达到高峰(P＜0.01)。与同时间点模型组比较，各治疗组大鼠EB含量均有不同程度降低(P＜0.05或P ＜0.01)，以24 h组降低最为显著(P ＜0.01)，见表1。

表1 各时间点脑组织EB含量测定结果(，μg/mL)

表1 各时间点脑组织EB含量测定结果(，μg/mL)

*:与模型组比较，P ＜0.05;#:与模型组比较，P ＜0.01

2.2 雌激素对脑缺血大鼠脑组织含水量的影响

与假手术组比较，局灶性脑缺血4 h模型组大鼠脑组织含水量增加(P＜0.05)，随缺血时间延长，脑组织含水量持续增加，至24 h达到高峰(P＜0.01)。与同时间点模型组比较，各治疗组大鼠脑含水量均有不同程度降低(P＜0.05或P ＜0.01)，以24 h组降低最为显著(P ＜0.01)，见表2。

表2 各时间点脑组织含水量测定结果(，%)

表2 各时间点脑组织含水量测定结果(，%)

*:与模型组比较，P ＜0.05;#:与模型组比较，P ＜0.01

2.3 雌激素对MCAO大鼠BBB超微结构的影响

假手术组血管内皮细胞结构完整，细胞间TJ存在，表现为细胞间深染的致密条带，内皮细胞外双层血管基膜连续(图1a)。24 h模型组毛细血管周围水肿，管腔内有少量的细长突触，基膜稍增厚，基膜外可见血管周细胞细胞核，内皮细胞内线粒体数目减少，部分核膜融合消失，BBB TJ部分开放，胶质疏松，内皮细胞中吞饮小泡明显增多(图1b)。24 h雌激素组与同时间点模型组相比，雌激素组超微结构表现明显改善，毛细血管周围水肿减轻，管腔内突触增多，基膜基本正常，血管内皮细胞结构较完整，可见较多的线粒体，细胞间TJ存在(图1c)。3 d模型组:BBB TJ多处开放，表现为电子深染物质减少，星形胶质细胞足突及毛细血管管周出现严重水肿(图1d)。3 d雌激素组BBB TJ开放较同时间点模型组减轻，星形胶质细胞足突及毛细血管管周水肿较轻(图1e)。

图1 雌激素对MCAO大鼠BBB超微结构的影响

2.4 Occludin蛋白的半定量分析

Western blot检测 Occludin蛋白表达，发现4 h模型组Occludin蛋白表达较假手术组减弱，但无统计学意义(P＞0.05)。24 h模型组Occludin蛋白表达较假手术组减弱，有统计学意义(P＜0.05)。3 d模型组Occludin蛋白表达进一步减弱，有统计学意义(P＜0.01)。4 h雌激素组 Occludin蛋白表达较同时间点模型组比较无统计学意义(P＞0.05)，24 h及3 d雌激素组Occludin蛋白表达较同时间点模型组比较均升高，有统计学意义(P ＜0.05)，见图2。

图2 Western blot检测Occludin蛋白表达

3 讨论

BBB通透性改变是脑缺血再灌注损伤的重要途径之一，在脑缺血再灌注损伤的病理生理过程中，BBB的损害明显加重。研究表明TJ是保持BBB完整性的重要因素，外伤、缺血、缺氧、感染、免疫及理化因素等均可能引起TJ结构及功能发生改变造成BBB损害，从而导致BBB的通透性升高引起脑水肿［8-9］。已知的研究表明雌激素有多方面的脑保护作用，如减轻脑缺血区脑灌注量的减少、降低兴奋性氨基酸(EAA)的释放、自由基的形成、钙通道的开放、细胞骨架的破坏、缺血再灌注损伤，改善记忆功能，增加胶质细胞的活性及脑的反应性修复能力等。

本实验主要通过雌激素预处理对去势大鼠MCAO后不同时间点血脑屏障通透性的影响来进一步阐述雌激素的脑保护作用。我们选择了脑含水量作为观察脑缺血再灌注后水肿程度的指标，以脑内伊文氏蓝(EB)含量作为指示血脑屏障损伤的指标，并结合电镜观察，发现大鼠局灶性脑缺血4 h，出现明显脑水肿，随缺血时间延长，脑水肿逐渐进展，至24 h，水肿达到高峰，与模型组比较，各治疗组脑水肿均有不同程度降低，以24 h组降低最为显著，说明雌激素能有效维护BBB的完整性，减轻脑水肿。我们通过检查EB含量发现，大鼠局灶性脑缺血4 h，模型组大鼠脑组织EB含量增加，随缺血时间延长，脑组织EB含量持续增加，至24 h，达到高峰，BBB通透性的变化与脑水肿变化一致。与同时点模型组比较，治疗组大鼠EB含量均有不同程度降低，以24 h组降低最为显著，说明雌激素可以通过维护BBB完整性，减轻脑水肿。

我们通过透射电镜观察显示，大鼠局灶性脑缺血24 h，雌激素组超微结构表现明显要好于模型组，毛细血管周围水肿相对较轻，管腔内突触增多，基膜基本正常，血管内皮细胞结构较完整，可见较多的线粒体，细胞间TJ存在。缺血3 d，雌激素组BBB TJ开放较模型组要少，星形胶质细胞足突及毛细血管管周水肿较轻。从以上结果来看，雌激素确实减轻了MCAO大鼠各时间点EB的渗透，减轻BBB内皮细胞间TJ的开放，维护了BBB的完整性，有效减轻了脑水肿。

有研究证实内皮细胞间紧密连接上的闭锁蛋白表达水平存在组织分布的不均一性，在脑内皮细胞，闭锁蛋白呈高表达［10］，而在非神经组织的内皮细胞为低表达［11］。在本实验中，我们发现模型组24 h组、3 d组Occludin蛋白表达较假手术组减弱，有显著性差异，雌激素组24 h及3 d组Occludin蛋白表达较同时间点模型组比较均升高，有显著性差异。说明随缺血再灌注时间的延长，Occludin蛋白表达逐渐减少，而雌激素可上调Occludin蛋白的表达，这与Han S.Kang等的研究结果相一致［12］。以上结果提示缺血再灌早期可能主要为细胞源性水肿，紧密连接尚未开放，随缺血再灌注时间的延长，紧密连接大量开放，血脑屏障完整性被破坏，血管源性脑水肿占主导地位。

雌激素可以减少紧密连接开放，改善血脑屏障完整性，我们分析可能原因有:①减少钙通道的开放。钙离子参与了各种细胞间连接的形成，并且对TJ正常功能的维持起了重要作用［13］，无论是细胞内的钙还是细胞外的钙离子都能够对TJ的活性进行调节。而雌激素可减少细胞外钙离子的内流，维持线粒体的钙负荷及其正常功能［14］。②TJ破坏后，其形成或再形成与Occludin磷酸化升高有关，尤其是发生在丝氨酸和酪氨酸残基上的磷酸化，谷氨酸增加Occludin蛋白酪氨酸的磷酸化，减少苏氨酸的磷酸化，而雌激素能降低脑缺血时细胞外谷氨酸的含量，抑制NMDA受体的过度激活，促进星形胶质细胞对谷氨酸的摄取，从而减少TJ的破坏。③胶质细胞对内皮细胞间TJ的形成有着重要影响，它在一定程度上加强、支持了屏障功能。④研究发现单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)除了对单核白细胞具有趋化活性以外，还能够下调TJ蛋白occludin的表达［15］。而雌激素能抑制MCP-1的表达及一些炎性因子表达［16］。

综上所述，通过实验，我们观察到雌激素可改善BBB超微结构，上调TJ occludin蛋白的表达，维护BBB的完整性，有效减轻脑水肿，进一步探讨了雌激素作为神经元保护剂可有效改善微血管的结构，但其具体机制尚有待进一步研究。

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