两种大鼠皮瓣缺血再灌注损伤模型的比较

刘蕴琦　刘艺芳　肖一丁　张明子　王晓月　马雪梅　王友彬

[摘要] 目的 比较大鼠腹部与背部缺血再灌注损伤（IRI）模型的差异，探讨更为合适的动物皮瓣IRI模型。 方法 选用健康SD雄性大鼠24只，随机分成4组，每组各6只，分别为腹部皮瓣缺血再灌注（aIR）组，腹部皮瓣假手术（aSH）组，背部皮瓣缺血再灌注（dIR）组及背部皮瓣假手术（dSH）组。腹部皮瓣以腹壁下浅动脉为蒂，背部皮瓣以髂腰浅动脉为蒂。术后5 d，观察大鼠死亡及皮瓣啃食损坏率，应用激光多普勒血流灌注成像仪计算成活区域平均血流灌注量及皮瓣成活率，HE染色进行组织形态学观察，TUNEL染色检测皮瓣组织细胞的早期凋亡，计算凋亡细胞阳性指数（AI）。 结果 dIR组死亡率（0.0%）、皮瓣啃食损坏率（0.0%）低于aIR组的16.7%与50.0%，差异有统计学意义（P < 0.05），且dIR组炎性浸润情况弱于aIR组。aSH组与dSH组的皮瓣成活率[（59.90±8.94）%、（97.63±1.29）%]及成活区域平均血流灌注量[（125.54±14.52）、（149.38±13.69）PU]分别高于aIR组与dIR组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。aSH组与dSH组AI[（13.48±5.23）%、（6.70±3.97）%]分别低于aIR组与dIR组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。dIR组皮瓣成活率[（53.30±5.40）%]、成活区域平均血流灌注量[（100.46±15.93）PU]较aIR组[（30.77±11.53）%、（39.45±9.94）PU]高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。dIR组AI[（43.72±6.15）%]较aIR组[（57.78±17.38）%]低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 背部皮瓣缺血再灌注损伤模型是较腹部皮瓣更为理想的模型。

[关键词] 缺血再灌注损伤；动物模型；大鼠；皮瓣

[中图分类号] R363 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（a）-0009-04

临床上，应用皮瓣进行组织修复和器官再造时，常会发生皮瓣缺血再灌注损伤。较长时间皮瓣缺血可引起缺血损伤，恢复血流灌注后，皮瓣的组织损伤会进一步加重[1]，从而导致皮瓣部分或完全坏死，影响手术成功率，因此，研究减轻皮瓣缺血再灌注损伤的方法具有重要的临床意义。皮瓣缺血再灌注损伤研究的动物模型主要有猪、家兔和鼠类皮瓣模型等，其中又以大鼠皮瓣模型最为常用[2]。既往经典的大鼠皮瓣缺血再灌注模型为腹部岛状皮瓣模型，此种模型在研究高压氧[3]和干细胞处理[4]等方法对皮瓣缺血再灌注损伤的治疗效果上取得了一定研究成果。但腹部皮肤常被大鼠啃食损坏，组织结构完整性差，且感染情况严重，实验结果稳定性差。利用背部皮肤建立皮瓣缺血再灌注损伤模型成为研究皮瓣缺血再灌注损伤的新方法。本实验旨在比较两种模型的优劣。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组

选用体重280～350 g，健康雄性SD大鼠24只，随机分成4组，每组各6只，分别为腹部皮瓣缺血再灌注（abdominal skin flap ischemia reperfusion，aIR）组：显微血管夹夹闭右侧腹壁下浅血管，阻断供血6 h；腹部假手术（abdominal skin flap sham operation，aSH）组：不进行缺血处理；背部皮瓣缺血再灌注（dorsal skin flap ischemia reperfusion，dIR）组：显微血管夹夹闭左侧髂腰浅动脉，阻断供血6 h；背部假手术（dorsal skin flap sham operation，dSH）组：不进行缺血处理。动物购于北京华阜生物科技股份有限公司，喂养于20～25℃的环境中，术前术后均采用自由喂食和饮水。本实验遵循国际动物委员会的相关规定并经北京协和医院动物伦理委员会批准。

1.2 模型制备

1.2.1 腹部皮瓣模型制备 10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，参照Küntscher等[5]的类似实验设计，将大鼠腹部剃毛，以腹中线为对称轴设计宽6 cm、长9 cm的皮瓣。术区消毒铺巾后，将皮瓣沿设计线切开，显露双侧腹壁下浅血管后，结扎并切断左侧动脉，形成以右侧腹壁下浅血管为蒂的腹部皮瓣，显微血管夹阻断供血6 h[6]，恢复皮瓣血供后将皮瓣原位缝合，皮瓣下置相应大小的硅橡胶片。腹部假手术组大鼠不进行缺血操作。

1.2.2 背部皮瓣模型制备 大鼠经10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，固定后备皮，以背部中线为对称轴设计宽6 cm、长9 cm的皮瓣。术区消毒铺巾后，将皮瓣沿设计线切开，暴露出血管，结扎右侧髂腰、双侧胸背浅动脉，以左侧髂腰浅动脉为蒂，充分游离皮瓣，显微血管夹阻断供血6 h，恢复皮瓣血供后将皮瓣原位缝合，皮瓣下置相应大小的硅橡胶片。背部假手术组大鼠不进行缺血操作。

1.3 动物存活率与皮瓣完整性观察

术后观察各组动物的存活和皮瓣的啃食损坏状况。由于自身啃食造成皮瓣部分缺失的视为皮瓣被啃食损坏。

1.4 皮瓣微循环检测

激光多普勒可直接观察皮瓣中的血流情况，监测皮瓣的微循环，区分坏死和成活区域。术后第5天，将大鼠麻醉后，用激光多普勒血流灌注成像仪（LDF，PeriScan PIM3，Perimed AB，Sweden）观测皮瓣血流情况。方法：将激光探头置于皮瓣区上部，设定相应的观测范围，包含皮瓣及周围正常皮肤。对设定区域的皮肤血流灌注量进行测量后，LDF自动报告测定范围内不同部位皮肤血流量数据及不同颜色图像。红色代表皮瓣血流灌注量最大，黑色代表最小甚至没有血流灌注，黄色和蓝色介于二者之间。图像颜色和皮瓣成活情况的关系是，红色、黄色以及与三者相连的蓝色区域视为皮瓣成活区，黑色视为皮瓣坏死区，蓝黑交界处视为皮瓣成活与坏死分界线。根据该分界线用移动鼠标在图像上人工标定皮瓣成活区（即红、黄和相邻部分蓝色区域），其面积值由与LDF配套连接的计算机自动计算生成并依此计算出皮瓣成活率。皮瓣成活率=（成活区域面积/皮瓣总面积）×100%。endprint

1.5 HE染色观察

于皮瓣蒂部的近端部位取1 cm2大小组织块，中性福尔马林缓冲液固定，石蜡包埋，制作切片，脱蜡水化，苏木精（中杉金桥，5 mL）5 min，1%盐酸酒精分化，伊红（中杉金桥，100 mL）5 min，自来水返蓝10 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。观察皮肤的组织学变化。

1.6 凋亡检测

末端脱氧核苷酸转移酶介导的d-UTP缺口末端标记技术（TUNEL）标记凋亡细胞：皮瓣组织切片脱蜡水化，置细胞通透液室温8 min，加入TUNEL反应混合液（Roche，Switzerland，50Tests），37℃孵育1 h，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，加入Converter-POD，37℃孵育30 min，PBS清洗，DAB（中杉金桥，10 mL）染色，苏木精复染，封片镜检。在病变典型处连续计数5个高倍视野（400×），每视野记数300个细胞中阳性细胞数，计数凋亡细胞数目及总细胞数目，以阳性细胞数所占总细胞数的百分比作为凋亡细胞阳性指数（AI），AI=（凋亡细胞数目/总细胞数目）×100%。

1.7 统计学方法

实验数据采用SPSS l7.0软件进行统计学分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物存活率与皮瓣完整性

假手术组均未见死亡。术后第2天aIR组死亡1只，死亡率为16.7%，dIR组未见死亡，死亡率为0.0%。术后5 d，aIR组皮瓣啃食损坏率为50.0%，dIR组为0.0%，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 皮瓣微循环检测

术后5 d，成活皮瓣质地柔软、颜色新鲜，坏死区域干瘪，颜色呈深棕或黑色。LDF扫描图像，坏死区域颜色为黑色（图1，封三）。根据LDF测出各组的成活区域平均血流灌注量，aSH组皮瓣成活率[（59.90±8.94）%]、成活区域平均血流灌注量[（125.54±14.52）PU]及dSH组皮瓣成活率[（97.63±1.29）%]、成活区域平均血流灌注量[（149.38±13.69）PU]分别高于aIR组与dIR组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。dIR组皮瓣成活率为（53.30±5.40）%，成活区域平均血流灌注量为（100.46±15.93）PU，高于aIR组的（30.77±11.53）%和（39.45±9.94）PU，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

2.3 HE染色观察

利用HE染色分析组织的炎性浸润情况（图2，封三），aIR组皮瓣组织内大量炎症细胞聚集，炎症细胞胞核被染成蓝色，多于dIR组，aSH组与dSH组皮瓣组织内基本未见炎症细胞聚集。

2.4 凋亡检测

凋亡染色完成后用显微镜观察染色情况（图3，封三），观察结果显示：aIR组与dIR组，TUNEL染色主要位于基底层细胞的核上，呈颜色深浅不一的棕色凋亡细胞。aSH组AI[（13.48±5.24）%]与dSH组AI[（6.70±3.97）%]分别低于aIR组[（57.78±17.38）%]与dIR组[（43.72±6.15）%]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。dIR组AI低于aIR组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。同时dIR组凋亡细胞染色程度较aIR组明显降低。aSH组与dSH组由于未进行缺血处理，未见明显凋亡细胞。

3 讨论

肿瘤切除及各种创伤常会造成体表组织器官的缺损，皮瓣移植是修复这类缺损的主要方法[7-8]。皮瓣部分或全部坏死将导致手术的失败，皮瓣坏死主要的原因是持续性皮瓣缺血或暂时缺血以及其后的缺血再灌注损伤。大鼠腹部皮瓣缺血再灌注模型能引起较单纯缺血，并且能直观地显示损伤程度，因此广泛地运用于皮瓣缺血再灌注损伤方面的研究[9]。但在实际造模中发现，腹部模型大鼠死亡率、皮瓣啃食损坏率高，血流恢复缓慢，皮瓣成活率及凋亡指数不稳定，导致造模效率低。

本实验中，假手术组皮瓣成活率及成活区域平均血流灌注量显著高于各自的缺血再灌注组，凋亡指数也显著低于缺血再灌注组，这表明各组模型的建立是成功的。大鼠存活过程中，腹部皮瓣与垫料长时间频繁接触，伤口受外界感染概率大且湿度较高，因存在个体差异，实验组内个体的炎性反应差别大，对研究皮瓣缺血再灌注损伤引发的无菌性炎症以及所表达的炎症因子的定量研究影响较大[10]，对凋亡因子的研究也有较大影响，同时还造成aIR组AI[（57.78±17.38）%]较dIR组[（43.72±6.15）%]稳定性差。在伤口愈合及皮瓣坏死过程中，局部不适感可引起大鼠啃食皮瓣，使皮瓣模型的损坏率上升。在正常状态下，大鼠腹部皮瓣平均血流灌注量低于背部，经血管夹夹闭并松开后，血流恢复缓慢，相比于缺血再灌注损伤造成的坏死，因缺血造成的皮瓣坏死面积所占比例增加，降低了实验结果的可信度。

近年来，Vourtsis等[11]、Wang等[12]分别研究了VEGF和bFGF对缺血再灌注损伤皮瓣成活的影响，Lima等[13]研究了电针刺激对皮瓣缺血再灌注损伤中氧化应激程度的影响，Vasilenko等[14]、Li等[15]分别研究了甲酸雌二醇和富含血小板的血浆对皮瓣缺血再灌注损伤皮瓣成活的影响，这些研究均采用大鼠背部皮瓣模型，这些研究大都采用背部任意皮瓣模型。目前，在皮瓣缺血再灌注损伤导致的皮瓣坏死与凋亡的通路研究中，背部皮瓣模型也更多地被应用。腹部皮瓣与背部皮瓣因所处位置的不用，两种皮瓣的血管分布、组织厚度和血运情况也存在差距。尽管更为复杂的如细胞因子等表达的差异难以进行直接比较，但从实验动物成活率、皮瓣完整程度、皮瓣成活率及凋亡指数的稳定性等直接关系到实验成功率的指标上考量，背部皮瓣模型在研究皮瓣缺血再灌注损伤时更具优势。endprint

[参考文献]

[1] Jennings RB，Sommers HM，Smyth GA，et al. Myocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog [J]. Archives of Pathology，1960，70：68-78.

[2] Carroll WR，Esclamado RM. Ischemia/reperfusion injury in microvascular surgery [J]. Head Neck，2000，22（7）：700-713.

[3] Qi Z，Gao CJ，Wang YB，et al. Effects of hyperbaric oxygen preconditioning on ischemia-reperfusion inflammation and skin flap survival [J]. Chin Med J（Engl），2013，126（20）：3904-3909.

[4] Reichenberger MA，Heimer S，Schaefer A，et al. Adipose derived stem cells protect skin flaps against ischemia-reperfusion injury [J]. Stem Cell Rev，2012，8（3）：854-862.

[5] Küntscher MV，Schirmbeck EU，Menke H，et al. Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a rat model [J]. Plast Reconstr Surg，2002，109（7）：2398-2404.

[6] 戚征，高春锦，孙学军，等.高压氧预处理促进皮瓣成活的研究[J].中华医学美学美容杂志，2009，15（1）：46-48.

[7] 申五一，柏亚萍，张理梅，等.局部皮瓣在头面部缺损修复中的应用[J].中华医学美学美容杂志，2011，17（4）：308-309.

[8] 詹太国，詹领，熊小刚，等.局部皮瓣在头面部皮肤肿瘤及皮肤病切除修复中的应用[J].中华医学美学美容杂志，2008，14（6）：370-372.

[9] Ames A，Wright RL，Kowada M，et al. Cerebral ischemia Ⅱ the no-reflow phenormenon [J]. Am J Pathol，1968，52（2）：437-453.

[10] 覃仕瑞，赵岭，谢飞，等.取样方式对大鼠皮瓣缺血再灌注损伤模型细胞因子测定的影响[J].中国生物工程，2012， 32（4）：67-71.

[11] Vourtsis SA，Spyriounis PK，Agrogiannis GD，et al. VEGF application on rat skin flap survival [J]. J Invest Surg，2012，25（1）：14-19.

[12] Wang Y，Orbay H，Huang C，et al. Preclinical efficacy of slow-release bFGF in ischemia-reperfusion injury in a Dorsal Island skin flap model [J]. J Reconstr Microsurg，2013，29（5）：341-346.

[13] Lima LP，Albuquerque AD，Silva JJD，et al. Electroacu puncture attenuates oxidative stress in random skin flaps in rats [J]. Aesthetic Plastic Surgery，2012，36（5）：1230-1235.

[14] Vasilenko T，Slezakm KM，Novotny M，et al. Pre-and/or postsurgical administration of estradiol benzoate increases skin flap viability in female rats [J]. Aesthetic Plastic Surgery，2013，37（5）：1003-1009.

[15] Li W，Enomoto M，Ukegawa M，et al. Subcutaneous injections of platelet-rich plasma into skin flaps modulate proangiogenic gene expression and improve survival rates [J]. Plast Reconstr Surg，2012，129（4）：858-866.

（收稿日期：2014-03-11 本文编辑：苏 畅）endprint