代谢组学技术在药物毒性评价中的应用

严妍 安柏松 房城 姜波

摘 要：代谢组学技术作为一种评估毒性的新的方法，已被广泛应用于药物的毒性预测、监测及药物的临床前安全评价中，本文对代谢组学技术的研究概况、研究方法及应用进行简单的论述。

关键词：代谢组学；毒性评价；研究方法

1 代谢组学的研究概况

代谢组学是对生物系统内的内源性代谢产物的一个全面评估，也是读取基因功能，酶活性，生理过程的一个所谓的“快照”。代谢组学也是对一系列不同方法整合的一个广义术语，其一为代谢指纹或代谢轨迹的分析，即是运用较少的代谢物的定量分析而通过多元频谱分析来衡量整个代谢轮廓，如建立在核磁共振光谱NMR或质谱MS基础上的主成分分析；其二为代谢标记物的代谢组学分析，在已知代谢物浓度的基础上由传统的统计方法及多元分析方法建立代谢产物的鉴定分析方法和代谢物含量的定量分析模式；其三为基于特定标记物的靶向代谢组学分析，通过对某几个选定的在某一特定的生化途径中有贡献的代谢标记物进行分析，来专注于研究整个代谢过程中的某一个阶段。

由于不同性质的化学品，代谢物和分子间的相互作用，代谢组学的分析需求造成了不同于基因组学和蛋白质组学分析的极其困难的挑战。先进的核磁共振波谱（NMR）和质谱（MS）的分析方法，在过去的十年间为人类代谢组学的分析与研究取得了大规模的突破。这一研究理论唤醒了学者们对人类疾病中新陈代谢的重要性的关注度，尤其是对癌症的重视程度。代谢组学具有对功能基因组学和蛋白质组学的功能读取作用，现在已被应用于许多疾病的诊断当中，主要是通过对代谢物谱的分析及对与代谢有关的生物标志物的发现，这在药理研究和治疗中亦应用广泛。最新研究进展表明代谢组学的方法能够通过人体内的条块代谢网络明确地跟踪某个单个原子，并有望以空前的速度破译人类代谢组的复杂性。这一研究方向将彻底改变我们对复杂的人类疾病、临床诊断、以及个性化疗法和药物反应的重新理解和认识。

2 代谢组学的研究方法

代谢组学的数据分析可以在光谱数据集或定量代谢数据集上使用的化学分析方法，包括主成分分析（Principal Component Analysis， PCA）、偏最小二乘判别分析 （Partial Least Squares-Discriminant Analysis， PLS-DA）、配对偏最小二乘判别分析（Orthonal Partial Least Square-Discriminate Analysis， OPLS-DA）等。化学光谱法只能给出光谱模式下的相关信息，而往往无法提供有关代谢标记物的鉴定或分类信息，但是光谱法结合代谢组学的多元统计分析手段（PCA、PLS-DA和OPLS-DA）依然是目前最常应用的手段，因为它在不需要对代谢物做出精确评价的情况下能够对大量的代谢物数据集的结果做出解释。通过这种方法，结合模式识别手段（Pattern Recognition）从特定疾病的角度来与对照组的代谢谱进行区分，过滤掉可能与疾病无关的代谢物的“噪音”，进而确定哪些特定的代谢标记物引起了模式的偏差。

在理想情况下，一个代谢组学研究应包括以下三个主要步骤：（1）数据采集。主要采集NMR谱图或MS谱图，以“正常”与“异常”来进行模式识别区分。（2）光谱分析和相应代谢产物的标识及鉴定，目的是找到标志性的反映组别差异的生物标记物。（3）特定代谢标记物的定量验证。然而，方法中的第一步，即化学光谱分析一般情况下可以忽略不计，直接对代谢标记物进行识别和量化，然后应用多变量分析到大量的数据集中。模式识别方法包含了对代谢轮廓及代谢产物可能发生微妙的变化的分析，并始终随着时间的推移对代谢标记物的水平变化进行实时监测。除了识别多个特定的代謝标记物外，通过参考已知的内源性代谢物数据库[1]，找出引起疾病发生或导致疾病加重的代谢物的变化或差异。随着时间的推移，代谢标记物水平的变化有可能是对疾病的进展或药物毒性的一个预测。随后，这些与疾病或毒性相关的代谢标记物的数据通过数据库被链接到相关的代谢通路，最终，相关的疾病作用机制的生成，将带来药物作用或毒性的一系列假说。

3 代谢组学在药物毒性评价中的应用

作为一种评估毒性的新的方法，基于核磁共振的代谢组学被用于尿液样本的分析实验[2]，相比传统的评价指标，如AST，ALT，CK等，代谢组学分析下的尿液代谢轮廓能够清晰地区分治疗前与治疗后治疗组与辛伐他汀组的毒性水平。通过多元统计分析鉴定了与毒性相关的毒性标志物。更重要的是，治疗组被进一步归类分为两个亚组：低毒性组（WT）和高毒性组（HT），这两个组别之间的差异亦被酶活性的改变和组织病理学检查所证实。随后的时间依赖性的实验研究表明，10天的毒性通过代谢轮廓及代谢途径，在6天内就能够被可靠地预测。Williams等利用高效液相串联质谱的分析方法从代谢组学的层面研究与D-丝氨酸引起的肾脏毒性相关的扰动规律，在正负离子模式下的尿液代谢轮廓分析中，发现色氨酸，苯丙氨酸和乳酸表达水平有所升高，而甲基琥珀酸和癸二酸的表达水平与对照组比较，有降低的迹象，说明丝氨酸对肾脏的毒性损伤与抑制色氨酸的分解代谢有关。赵剑宇[3]等利用代谢组学技术对关木通毒性大鼠的代谢改变及毒性靶器官肾脏毒性的作用机制进行了研究，结果发现氧化三甲胺、牛磺酸、柠檬酸、肌酐、2-酮戊二酸等代谢产物均有不同程度的下降，而乙酸、丙氨酸则出现显著的升高，表明染毒大鼠出现了肾小管坏死，这一结论与报道的肾脏病理组织学检查结果和血浆生化检测结果相一致。王喜军[4]等人采用UPLC-MS分析手段研究以CCL4诱导的肝损伤大鼠为实验对象，研究肝毒性的代谢组学的变化，同时对茵陈蒿汤干预后的肝损伤大鼠的代谢轨迹的回调趋势亦进行了相关研究，结果表明，与CCL4诱导的肝损伤相关联的Glycocholate 等5个生物标记物在给予茵陈蒿汤后，代谢标记物的表达水平与对照组比较未见明显的差异，说明茵陈蒿汤对CCL4诱导的肝损伤有一定的预防作用。李建新[5]等利用代谢组学方法中的模式识别技术和主成分分析法来探讨雷公藤甲素对肾脏所致的毒性作用，结果发现雷公藤甲素给药后，大鼠尿液样品中的代谢产物甘氨酸、醋酸盐、甜菜碱、丙酮的表达水平均有显著的升高，说明雷公藤甲素对大鼠产生的毒性首先是对肾脏皮层S1段造成损伤，随后是肾乳头的损伤，最后是对肾脏皮层S3段的损伤。

参考文献

[1]Lewis GD， Asnani A， Gerszten RE. Application of metabolomics to cardiovascular biomarker and pathway discovery[J].J Am Coll Cardiol.2008，52：117-123.

[2]吴泽明，孙晖，吕海涛，等.代谢物组学研究进展及其在中医药研究中的应用展望[J].世界科学技术-中医药现代化，2007，9（2）：99-103.

[3]赵剑宇，颜贤忠，彭双清.利用代谢组学技术研究中药关木通的肾毒性作用[J].世界科学技术：中医药现代化，2007，9（5）：54-59.

[4]王喜军，王萍，孙晖，等.茵陈蒿汤对ANIT 诱导的急性肝损伤的保护作用[J].中医药学报，2007，35（4）：17-21.

[5]李建新，华嘉，何翠翠.中药毒性的代谢组学研究雷公藤甲素的肾脏毒性[J].亚太传统医药，2007，3（7）：41-45.