氟灭酸对豚鼠微动脉平滑肌细胞间缝隙连接的抑制作用＊

张治平，司军强，李新芝，李 丽，赵 磊，魏丽丽，于秀石，马克涛△

（石河子大学医学院：1.生理学教研室；2.病理生理学教研室，新疆石河子832002）

氟灭酸（flufenamic acid，FFA）是临床常见的非甾体抗炎药物，研究发现氟灭酸能够阻断Cl－通道［1－2］、调节非选择性阳离子通道［3－4］，还可以抑制培养的成纤维细胞和神经母细胞瘤细胞间的缝隙连接通道［5］。本实验主要研究氟灭酸对急性分离的微动脉细胞间缝隙连接通道的电生理特性影响。许多组织和器官上都表达有缝隙连接存通道，是细胞间进行电化学信息通讯的直接途径［6－7］。缝隙连接通道由相邻的两个细胞各提供一个连接子对接而成，每个连接子由6个不同或相同的连接蛋白（connexin，Cx）构成，缝隙连接通道的孔径约1.5nm，允许相对分子量小于1KD的分子通过。目前发现超过20种Cx表达在不同的细胞［6，8］。

缝隙连接在维持人体正常生理功能中扮演着重要角色，在血管舒缩运动中更为突出［9－13］。调节血管舒缩运动的电、化学信息在平滑肌细胞和内皮细胞之间传递，以及平滑肌细胞的同步化都需要缝隙连接功能和结构的完整性［9，14］。为了研究缝隙连接在生理和病理生理状态下所发挥的作用，特异性缝隙连接阻断剂是必不可少的。有报道发现在培养的细胞上氟灭酸能够抑制细胞间的缝隙连接通讯［5］，但在急性分离的血管段标本上尚未见相关报道。本实验采用微动脉段全细胞膜片钳技术在急性分离的脑动脉（brain？artery，BA）和肠系膜动脉（mesenteric artery，MA）上，研究氟灭酸对血管平滑肌细胞间缝隙连接通道电生理特性的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验所用豚鼠（新疆维吾尔自治区疾病控制中心动物饲养科提供，动物质量符合一级标准）雌雄不限，体质量约200～300g，麻醉状况下放血处死，迅速取出肠系膜和脑，置于生理盐溶液中，生理盐溶液成分如下：NaCl 138.0mmol／L，KCl 5.0mmol／L，CaCl21.6mmol／L，MgCl21.2mmol／L，Na－HEPES 5.0mmol／L，HEPES 6.0mmol／L，葡萄糖7.5mmol／L。生理盐溶液中迅速取出BA和MA。所用药物用生理盐溶液配制，通过开关控制药物灌流标本，保持灌流速度、温度和其他成分不变。所用药物有：氟灭酸由Sigma公司提供，其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 微动脉段标本制备 截取好的微动脉标本置于直径35mm的培养皿中，血管微动脉长约0.4mm，直径在40～80 μm之间，两端用细铂金片固定在培养皿底部，在37℃温箱中用含有胶原酶A（1.5mg／mL）的生理盐溶液处理15min，生理盐溶液置换2次去除残存胶原酶A，体显微镊下进一步去除附在微动脉上的结缔组织。

表1 微动脉段上和单个平滑肌细胞的膜电生理特性的比较

1.2.2 单个平滑肌细胞制备 将微动脉置于细胞分离液中20min，细胞分离液成分为：NaCl 142.00mmol／L，KCl 5.00 mmol／L，CaCl20.05mmol／L，MgCl21.00mmol／L，Na－HEPES 4.00mmol／L，HEPES 5.00mmol／L，葡萄糖 7.50 mmol／L。将微动脉剪成几段放入消化液后，在37℃温箱中消化20～25min，消化液成分包括：木瓜蛋白酶0.75mg／mL，胶原酶Ⅰ1.00mg／mL，牛血清清蛋白3.75mg／mL，二硫苏糖醇0.30mg／mL。1 000r／min离心6min后弃上清液，加入细胞分离液制成细胞悬浮液，如此反复替换3次后，将液体移至用多聚赖氨酸处理过的培养皿内，静置30min使细胞贴壁。生理盐溶液冲洗20min后进行全细胞膜片钳实验。

1.2.3 全细胞膜片钳记录 室温条件下（22～25℃）标本持续灌注生理盐溶液（0.2mL／min）进行全细胞膜片钳实验。记录电极阻抗约为5MΩ，P－97拉制仪拉制。电极内液成分是：K－gluconate 130.0mmol／L，NaCl 10.0mmol／L，CaCl22.0 mmol／L，MgCl21.2mmol／L，HEPES 10.0mmol／L，EGTA 5.0mmol／L，葡萄糖7.5mmol／L。通过微操纵器接触到细胞后给予负压形成GΩ封接。补偿电极电容后给予瞬时较强负压或者电刺激击破细胞膜形成全细胞膜片钳，膜电流用10 kHz（－3dB）低频滤过［15］。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行分析，计量资料以s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 微动脉平滑肌细胞间的缝隙连接 微动脉段上和单个平滑肌细胞的细胞膜电生理特性（表1），MA和BA微动脉段上平滑肌细胞Cinput大约是消化分离的单个平滑肌细胞的10倍，Ginput大约是单个平滑肌细胞的20倍。

图1 氟灭酸对微动脉平滑肌细胞间缝隙连接的抑制作用

2.2 氟灭酸抑制微动脉平滑肌细胞间的缝隙连接 应用氟灭酸前细胞膜电流幅度显著大于应用氟灭酸（300μmol／L）后（图1），细胞Rinput从0.32GΩ增加到2.15GΩ。表2总结了氟灭酸对微动脉段平滑肌细胞Cinput、Rinput和Ginput的影响，应用氟灭酸干预后记录平滑肌细胞的Cinput、Rinput和Ginput与表1中单个细胞的数值十分接近。此外，应用单指数方程分别对氟灭酸干预和对照组记录平滑肌细胞膜电容充放电过程进行拟合。结果发现，氟灭酸干预前拟合效果较差（r≤0.90），干预后拟合效果较好（r＞0.98），细胞Cinput的充放电的时间常数也由11.00ms减少至0.32ms。

表2 氟灭酸对微动脉段上平滑肌细胞膜电生理特性的影响

应用斜坡电压刺激显示氟灭酸净电流的电流／电压（I／V）曲线呈线性（图2），且微动脉段上记录平滑肌细胞的静息电位与翻转电位点十分接近，提示氟灭酸主要抑制相邻细胞间缝隙连接通道。

图2 氟灭酸净电流的I／V曲线

图3 氟灭酸浓度依赖的抑制微动脉上平滑肌细胞膜电导

2.3 氟灭酸浓度依赖的抑制微动脉平滑肌细胞间缝隙连接氟灭酸可以浓度依赖性的抑制微动脉上平滑肌细胞间缝隙连接（图3），氟灭酸（1～1 000μmol／L）能够浓度依赖的减少微动脉段上平滑肌细胞的Ginput。经绘制曲线发现氟灭酸抑制BA和MA细胞间缝隙连接通道的IC50分别为33和56μmol／L，氟灭酸抑制两种微动脉细胞间缝隙连接通道的差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

本实验在BA和MA上通过以下3个方面得以证实氟灭酸可以可逆和浓度依赖的抑制细胞间缝隙连接通讯：（1）氟灭酸能够增加微动脉段上平滑肌细胞的Rinput至单个平滑肌细胞水平；（2）氟灭酸可以减小微动脉段上平滑肌细胞Cinput值和Ginput值接近于单个细胞；（3）氟灭酸后能够降低细胞膜充放电时间至单个细胞水平，且单指数方程能够较好的拟合［16－17］。结果提示，当氟灭酸的浓度≧300μmol／L时BA和MA微动脉段上平滑肌细胞间的缝隙连接通道可以被完全抑制。此外，氟灭酸对BA和MA两种微动脉细胞间缝隙连接通道的抑制作用无统计学差异，提示相同的连接蛋白表达在上述两种微动脉。

Harks等［18］报道在健康大鼠肾成纤维细胞和过表达Cx43的SKHep1细胞上氟灭酸可以阻断细胞间的缝隙连接通讯，IC50是40μmol／L，当浓度大于或等于250μmol／L时氟灭酸可以完全阻断细胞间的缝隙连接通讯。此结果与本实验的结果一致。血管微动脉主要表达Cx37、Cx40、Cx43和Cx45，其中平滑肌细胞上主要表达Cx37、Cx43和Cx45，内皮细胞上主要表达Cx37、Cx40和Cx43［13］。本实验结果提示，在 MA和BA微动脉上平滑肌细胞间缝隙连接通道可能是由Cx43和其他几种连接蛋白组成的异聚体。另有文献报道，在N2A神经母细胞瘤上氟灭酸能够非选择性阻断由Cx26、Cx32、Cx40、Cx43、Cx46和Cx50分别组成的缝隙连接通道［19］。

缝隙连接是相邻细胞间的连接通道排列而组成的一种特殊膜结构，能够允许某些离子以及相对分子质量小于1×103的分子自由通过，是细胞间进行物质交换和信息通讯的途径［20］。缝隙连接与血管紧张度的调节密切相关，通过缝隙连接电化学信号的直接交流，使血管能够保持电和机械活动的同步性，对刺激信息作出同步性的反应，保证血管舒缩功能的一致和稳定。病理情况下，伤害性信息也能够相邻细胞间存在的缝隙连接通道进入正常细胞，进而使正常细胞出现病理性改变［9］，如果提前应该缝隙连接阻断剂阻断异常细胞与正常细胞间的缝隙连接通道，则伤害性信息不会传递至正常细胞。Saltman等［21］发现在心肌梗死的动物模型上提前应用了缝隙连接阻断剂庚醇，心肌梗死的面积显著降低。因此，缝隙连接阻断剂将会是治疗心脑血管疾病非常重要的工具。

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