湖南省柿树叶片中黄酮类化合物含量的分析

孙化鹏，张 珉，曹雄军，钟晓红

（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙410128；2.湖南省林业科学院，湖南 长沙410004）

柿（Diospyroskaki Thunb）为柿树科柿属植物，是重要的经济树种[1]，其果实具有较高的营养价值，其叶片也有很好的药用功效[2-3]。柿树叶片入药最早记载于《滇南本草》，随后在诸家本草及医（药）书中也多有记载[4]。随着现代提取分离技术以及波谱学、药理学的发展，国内外研究人员对柿树叶片化学成分进行深入研究，分离鉴定出金丝桃苷、山萘酚葡萄糖苷、山萘酚木糖苷、山萘酚鼠李糖苷、山萘酚阿拉伯糖苷等多种黄酮类化合物[5-8]，并结合药理活性试验证明了这些化合物在止血、抗氧化、抑菌消炎、防癌抗癌、抗过敏等方面的药用功能，是柿树叶片的主要功效成分[9-11]。

采收黄酮类化合物含量高的柿树叶片原料，是炮制高质量柿树叶片药材的基础。但柿树叶片黄酮类化合物是次生代谢产物，其在柿树叶片中的含量积累随着生长周期的变化而变化，且不同品种柿树叶片中的含量也有所差异。为获得高质量的柿树叶片药材原料，优选高黄酮含量的品种资源以及确定适宜的采收时期，试验以湖南省长沙市牛心柿树叶片为试材，通过建立一种稳定、可靠、重现性好的柿树叶片黄酮类化合物高效液相色谱（HPLC）分析检测方法，对不同生长时期柿树叶片中黄酮类化合物进行比较分析，探讨柿树叶片黄酮类化合物的代谢累积规律，并检测分析了湖南省不同地区、不同品种柿树叶片中黄酮类化合物的含量[12]，以期为选择合理适宜的柿树叶片采收时期和优选高含量的柿树叶片品种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以2010年采集的湖南省7个地区17个不同品种柿树新鲜叶片为材料，具体采样地点见表1。将采集的柿树叶片洗净后置于60℃鼓风干燥箱中干燥至恒重，粉碎后密封备用。

1.2 试验方法

1.2.1 样品溶液的制备 称取干燥柿树叶片粉末1.0 g，用60%乙醇溶液超声辅助提取后定容至100m L，超声脱气后过0.45μm微孔滤膜，即为待测样品溶液。

1.2.2 HPLC检测条件 试验采用岛津LC10高效液相色谱（SPD-20A检测器）进行检测。色谱条件如下：色谱柱为C18柱（φ4.6mm×150 nm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；二元高压梯度洗脱：0～30min，15%A；30～60min，15%～20%A；60～70min,20%～30%A；70～85min，30%A；85～90min，30%～80%A；检测波长360nm；流速1m L/min；进样量20μL；柱温30℃。

1.2.3 检测方法的精密度及样品溶液的稳定性 取同一待测样品溶液按上述检测条件连续进样测定5次，计算各峰峰面积的相对标准偏差，以考查该HPLC检测方法的精密度。取同一待测样品溶液分别于配制后0、6、12、24 h进样测定，计算各峰峰面积的RSD值，以考查样品溶液的稳定性。

1.2.4 不同生长时期柿树叶片中黄酮类化合物含量的变化 以湖南长沙牛心柿为材料，分别对3月28日、4月25日、5月28日、6月29日、7月25日、8月25日、9月25日和10月29日采集的柿树叶片进行测定，以分析不同生长时期柿树叶片黄酮类化合物含量的变化。

1.2.5 不同品种的柿树叶片中黄酮类化合物含量的比较 对湖南省不同地区不同品种的柿树叶片进行测定，以比较各品种柿树叶片中黄酮类化合物含量。

2 结果与分析

2.1 HPLC分析方法的检验

2.1.1 色谱图 在1.2.2的色谱条件下，样品中柿树叶片黄酮类化合物各峰之间分离度较好，基本达到基线分离，色谱图见图1。采用该方法检测到的柿树叶片中黄酮类化合物峰达10个以上，且大多为未知黄酮类化合物，若要通过标准对照品来计算单一化合物的含量，就得先对各峰的物质逐一分离提纯，再进行质谱分析得出各峰所代表的具体物质，这样操作的难度较大，因此，试验结果以峰面积总和进行分析，以简化操作过程，节省检测时间。

图1 柿树叶片黄酮类化合物HPLC色谱图

2.1.2 精密度和稳定性 取同一待测样品溶液连续进样测定5次，各峰峰面积的相对标准偏差（RSD）值在0.51～1.96之间，表明试验仪器精密度良好。取同一待测样品溶液于0、6、12、24 h进样测定，各峰峰面积的RSD值在0.93～1.73之间，表明待测样品在24h内稳定，变异系数低。

2.2 不同生长时期柿树叶片黄酮类化合物含量的变化

从图2中可以看出，3月下旬柿树刚刚萌发新叶时，柿树叶片总黄酮含量较高，随着植株开花结果，柿树叶片中黄酮类化合物含量逐渐降低，6月底降至最低值，而在果实膨大期，即从7月下旬开始柿树叶片黄酮类化合物含量又逐渐升高，到果实成熟时达到全年最高值，然后柿树叶片进入落叶期，柿树叶片黄酮类化合物含量有所下降，但降幅不大。

图2 不同生长时期柿树叶片中黄酮类化合物含量变化趋势

2.3 不同品种柿树叶片黄酮类化合物的含量

湖南省柿树品种资源调查结果显示，湖南省的柿树品种既有次郎、阳丰、新津20、三代斤等甜柿品种（均以柿果园管理方式栽培种植）；又有腰带柿、盅柿、牛心柿、柿花、甜柿等野生涩柿品种。由表1可知，所测样品中柿树叶片黄酮类化合物含量最高的是永州市祁阳县的次郎甜柿品种，最低的是邵阳市洞口县的腰带柿。

表1 湖南省各地区不同柿树品种叶片中的黄酮类化合物含量

进一步分析可知，在同一地区，气候条件和栽培管理条件相同的情况下，不同品种间柿树叶片黄酮类化合物含量有明显差异；而不同地区同一品种间含量差异较小。例如：永州市祁阳县的次郎甜柿叶片黄酮类化合物含量要高于同一柿果园栽培种植的三代斤甜柿，但与洪江市群峰乡的的次郎甜柿差异不大。另外，同一地区不同栽培管理条件下，不同品种间柿树叶片黄酮类化合含量也有明显差异，以柿果园栽培管理的甜柿品种柿树叶片中黄酮类化合物的含量远高于野生涩柿品种的含量。

3 结论与讨论

柿树叶片黄酮类化合物主要以黄酮苷的形式存在，且分子结构式多种多样，很多试验研究在检测分析时采用传统比色法，以芦丁为对照品或者是将样品水解后以槲皮素和山奈酚为对照品来计算[13-14]。而该研究在试验过程中发现所制备样品中槲皮素、山奈酚、芦丁的含量都比较少，甚至没有这3种物质的存在，故不能以这几种物质作对照，为提高检测结果的准确性，试验采用HPLC检测方法，通过计算图谱中各峰峰面积总和来分析比较样品中黄酮类化合物的含量差异，该方法相对传统的比色法而言，结果更可靠，且操作简单。

柿为落叶果树，叶片生长周期为3月上旬到11月中旬，根据试验得出的柿树叶片黄酮类化合物代谢累积规律，3月和4月上旬即新叶萌发期可结合柿树修剪采集嫩叶制作柿树叶片茶；9～10月果实采收后采集柿树叶片炮制成中药材或作为生产柿树叶片提取物的原材料。

优良品种的选择是柿果园建设的基础，试验结果表明，柿树叶片黄酮类化合物的含量与柿树品种特性有直接关系，同时合理完善的栽培管理方式对提高柿树叶片黄酮类化合物含量也有较大影响。

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