四种水体微生物总DNA提取方法的比较

2014-09-22赖树锦郭佳陶新园李阳杨振飞陈鑫

湖北农业科学 2014年10期

赖树锦+郭佳+陶新园+李阳+杨振飞+陈鑫+李晓华

摘要:用Roling法、SDS法、CTAB改进法和Crump改进法提取水体微生物总DNA,并以细菌的16S rDNA通用引物进行PCR扩增。研究结果表明,四种提取方法提取的水体微生物总DNA大小都在23 kb以上,Roling法提取的水体微生物总DNA的浓度明显小于其他3种方法,Crump改进法提取的水体微生物总DNA的A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm比值高于其他3种方法,Crump改进法所提取的微生物总DNA可以直接用于后续的PCR扩增试验。

关键词:水体微生物;总DNA提取;DNA质量;PCR扩增

中图分类号:Q939文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)10-2440-03

Comparison of Several Methods for Extraction of Total Community for Water

LAI Shu-jin,GUO Jia,TAO Xin-yuan,LI Yang,YANG Zhen-fei,CHEN Xin,LI Xiao-hua

(Key Lab for Biotechnology of the State Ethnic Affairs Commission/College of Life Science, South -Central University for Nationalities, Wuhan 430074,China)

Abstract: The total community DNA from water was extracted by the Roling method, SDS method, CTAB method and Crump method respectively, then the universal primers for 16S rDNA was used for PCR amplification.The results showed that the DNA extractions were above 23.1 kb. The lesser amount of DNA and little impurities were extracted by Roling method , Highest amount of DNA was extracted by Crump method . Which A260/A280 andA260/A230ratio is higher than other three methods.

Key words: water; DNA extraction; DNA qulity; PCR amplification

基金项目:国家自然科学基金项目(31070087,30570046);湖北省自然科学基金重点项目(2011CDA079);国家大学生创新创业训练项目(GCX13104);湖北省烟草公司面上资助项目(0710XYYC2012-01)

水体中微生物种类繁多、数量巨大。污染的水体中微生物尤其多,种类仅次于土壤[1]。微生物具有很强的降解和转化污染物的能力,因此在被污染的水体中起着重要的作用[2-3]。微生物的多样性和群落结构的研究一直沿用分离、培养、鉴定并描述特征的传统方法,然而研究证明至今自然界中85%~99.9%的微生物不可培养,依赖传统的方法将损失大部分微生物资源。因此,很多研究者更倾向于从环境中直接提取微生物的总DNA,利用16S rDNA基因序列分析来研究生态系统中微生物的种群结构[4]。

由于水体环境复杂,从水体中抽提的微生物总DNA存在很多抑制因子,如腐蚀酸、腐殖酸样物、酚类化合物等[5]。这些抑制因子会严重抑制PCR反应和酶切分析的进行[6]。因此从水体中提取高质量的微生物总DNA是分子水平研究水体微生物多样性的重要步骤。

本研究通过对四种水体微生物总DNA提取方法进行比较分析,确定了一种较理想的水体微生物总DNA提取方法,为更好地开发利用水体未培养微生物资源提供了有力工具。

1材料与方法

1.1材料

水样取自武汉市南湖。

1.2水样预处理

取试验所用的新鲜南湖水样,用真空泵对其进行过滤,压力为0.3 MPA,滤膜孔径为0.22 μm,直径为10 cm,压滤后将滤膜放置于-20 ℃保存,用于后续试验。

1.3水体微生物总DNA的提取

1.3.1Roling法[7]用0.8 mL缓冲液(1% SDS、120 mmol/L K2HPO4)重悬沉淀,转移至2 mL专用离心管内,加入0.6 g直径为0.1 mm的玻璃球和0.7 mL饱和酚,用Bead beater以4 200 r/min振荡3次,每次30 s,取上清。

1.3.2SDS法[8]用700μL SDS裂解液重悬沉淀,加300 μL60 mg/mL溶菌酶,37℃温育1h,加4 μL200mg/mL蛋白酶K和240μL 10% SDS,55 ℃温育30min。13 000r/min离心5min,取上清。

1.3.3CTAB改进法[9]沉淀重悬于400μL pH 8.0的STET缓冲液(8%蔗糖、0.5% Tween-20、50 mmol/L EDTA、50mmol/L Tris)中,加入80μL 50 mg/mL溶菌酶,加入20% SDS至终浓度为0.5%,加入200mg/mL蛋白酶K至终浓度为100μL/mL,混均后37 ℃温育1h。加入5mol/L NaCl至终浓度为0.5 mol/L,加80 μL pH 8.0CTAB溶液(5% CTAB、120 mol/L K2HPO4)混匀,65 ℃温育10 min。13 000 r/min离心5 min,取上清。

1.3.4Crump 改进法[10]加入3 mL pH 8.0 DNA提取液(100 mmol/L EDTA、100 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、1.5 mol/L NaCl、0.01 g/mL PVPP、2% CTAB、100 mmol/L pH 8.0磷酸盐缓冲液)充分漩涡震荡,加入0.1 mL 50 mg/mL溶菌酶,37 ℃水浴1 h,每隔15 min轻轻震荡混匀,加入10% SDS至终浓度为0.5%,65 ℃水浴1 h,每隔15 min轻轻震荡混匀,13 000 r/min离心5 min,取上清。

1.4DNA抽提和沉淀

分别用等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1体积比)、氯仿/异戊醇(24∶1体积比)、氯仿各抽提一次,每次抽提用13 000 r/min离心10 min后取水相。加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠、0.6倍体积的异丙醇,常温下放置2 h,13 000 r/min离心20 min,取沉淀。加入0.5 mL 70%(体积分数)乙醇洗涤,重复3次,每次轻轻混匀洗涤、离心、弃乙醇。37 ℃放置,晾干后溶于20 μL TE,-20 ℃保存。

1.5DNA纯度的测定

用紫外线分光光度法分别测定DNA溶液的A260 nm、A280 nm和A230 nm,用A260 nm /A230 nm、A260 nm /A280 nm、蛋白质的浓度(μg/mL)和核酸的浓度(ng/μL)作为评价指标。

1.6PCR扩增反应

用细菌的16S rDNA通用引物进行扩增,P1:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,P2:5-TACCTT GTTACGACTT-3。PCR反应体系为20 μL,包括模板DNA1 μL、Buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、20 pmol/μL 引物1(P1)1 μL、20 pmol/μL引物2(P2)1 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL,去离子水13.5 μL。PCR反应程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,30个循环;72 ℃延伸30 min,4 ℃保温1 h。

2结果与分析

2.14种水体微生物总DNA提取方法的DNA提取量和分子量大小

用4种水体微生物总DNA提取方法提取南湖水体中微生物总DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图1所示,4种方法均可以提取出南湖水体中微生物总DNA,4种提取方法提取的总DNA大小都在23 kb以上,Roling法提取的南湖水体中微生物总DNA的浓度明显小于其他3种方法。

2.24种水体微生物总DNA提取方法的DNA纯度

从水体中提取的微生物总DNA容易受到蛋白质、腐殖酸、酚类化合物等物质的污染[11],进而影响后续的实验操作。通常用A260 nm/A280 nm比值表征DNA受到蛋白质和酚类物质的污染状况,用A260 nm/A230 nm比值表征DNA受到糖类、盐类等杂质的污染状况。由图2可知,Roling法提取的水体微生物总DNA A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm比值均小于1.5,表明蛋白质、腐殖酸等杂质成分较多,SDS法和CATB改进法所提取的水体微生物总DNA的纯度有所提高,Crump改进法提取的水体微生物总DNA纯度最高。

2.3PCR扩增结果

为检验从水体中提取的微生物总DNA能否用于后续的PCR扩增等试验,以所提取的微生物总DNA为模板,用细菌的16S rDNA通用引物进行PCR扩增,凝脉电泳检测结果如图3所示。Roling法、SDS法和CTAB改进法所提取的微生物总DNA扩增不出条带,表明这3种方法提取出的DNA受污染情况严重,与2.2中DNA纯度分析的结果一致;只有Crump改进法所提取的微生物总DNA能扩增出目标条带,表明Crump改进法所提取的微生物总DNA纯度高于其他3种方法,可以直接用于后续的PCR扩增等试验。

3讨论

由于水体中微生物种类繁多、数量巨大,常规培养法无法体现水体微生物的多样性和种群情况。鉴于以上研究现状,基于群体基因组的方法研究水体微生物多样性的策略得到了广泛应用,其中最关键的是高质量水体微生物总DNA的提取。

本研究用Roling法、SDS法、CTAB改进法和Crump改进法提取水体微生物总DNA,四种方法都可以提取出南湖水体中微生物总DNA,但在DNA纯度上存在差异,Crump改进法提取的水体微生物总DNA纯度最高,可以用于后续的PCR扩增试验。

参考文献

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