酶法破壁转化废菌体制备甲壳低聚糖

江得源+吕梦圆+石佳仙+蔡俊+胡瑛

摘要：试验采用酶法转化柠檬酸发酵后的废菌体，研究了酶法破壁及降解细胞壁几丁质制备甲壳低聚糖的工艺条件。采用红外光谱法对破壁后产物的化学结构进行表征，采用乙酰丙酮法测定几丁质酶降解产物中乙酰氨基葡萄糖还原糖的含量。结果表明，破壁产物的主要成分是（1-3）-a-D-葡聚糖和几丁质的复合物，10 mg废菌丝体破壁产物中加入0.3%几丁质酶降解反应7 d后可得到0.23 mg乙酰氨基葡萄糖还原糖。该方法制备甲壳低聚糖条件温和、工艺简便，为发酵废渣的综合利用开辟了新途径。

关键词：废菌体；酶法；破壁；降解；甲壳低聚糖

中图分类号：TS245.9文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）10-2404-04

Enzymatic Conversion of Chitooligosaccharides from Waste Mycelia

in Citric Acid Plant

JIANG De-yuan，L？譈 Meng-yuan，SHI Jia-xian，CAI Jun，HU Ying

（College of Bioengineering， Faculty of Light Industry， Hubei Univeristy of Technology/Key Laboratory of Fermentation Engineering Ministry of Education/Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation， Wuhan 430068，China）

Abstract： Waste mycelia from citric acid production plant were used to produce chitooligosaccharides by enzymatic cell wall breaking and enzymatic degradation. The process conditions of the cell wall breaking and degradation by enzymes were investigated. FT-IR spectra were used to characterize the chemical structure of the product from the cell wall breaking. Acetylacetones method was used to determine the content of N-acetyl-glucosamine reducing sugar. The results showed that the product from the cell wall breaking was the complex polysaccharide with （1-3）-a-D-glucan and chitin. Degradation by 0.3% chitinase with 10 mg products from the cell wall breaking for 7 d， 0.23 mg of N-acetyl-glucosamine reducing sugar was obtained. This new method is devised to obtain N-acetyl-glucosamine and disaccharides with stable properties and many important biological activities and functions by mild reaction and less environmental pollution. A new way for the comprehensive utilization of fermented waste is developed.

Key words：mycelia； enzymatic preparation； cell wall breaking； degradation； Chitooligosacchides

基金项目：湖北工业大学高层次人才启动项目（BSQD0813）；2012年全国大学生创新创业训练计划项目（201210500030）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31201425）

发酵行业生产抗生素、有机酸后产生大量废菌丝体，作为发酵行业的副产物，对环境造成了极大的污染，但作为一种可再生资源，综合利用具有重要意义。黑曲霉是发酵工业最常用的真菌，也是含有几丁质最多的真菌，其产量十分惊人，我国柠檬酸产量达50万t，产黑曲霉干菌体超过8万t，可从中提取到约1.6万t的几丁质，因此利用柠檬酸工厂废菌体提取几丁质、壳聚糖或者甲壳低聚糖具有非常广阔的应用前景[1]。

目前国内利用柠檬酸厂废菌体提取几丁质和壳聚糖大多采用酸碱法[2，3]，工艺简单、操作方便，但污染环境且样品纯度及得率都较低。而采用生物法可大大减少环境污染，同时显著提高产品的质量与产率，因此采用生物法利用柠檬酸工厂废菌体提取或制备甲壳素及其低聚糖有很好的应用前景。有研究者采用生物法利用柠檬酸发酵工厂废菌体制备壳聚糖，避免了酸碱法给环境带来的污染，分别选择蜗牛酶和溶菌酶、中性蛋白酶和几丁质脱乙酰酶来破碎细胞、脱蛋白及脱乙酰基，使黑曲霉细胞壁中的几丁质转化为壳聚糖。但真菌细胞壁的主要成分是（1-3）-β-D-葡聚糖和一些（1-6）-β-D-葡聚糖连接的长链，几丁质链还原端的N-乙酰氨基葡萄糖通过（1-4）-或（1-2）-连接到侧链的葡萄糖单元上[4]。所以，很难得到纯净的几丁质。采用专一性强的几丁质酶直接降解细胞壁中的几丁质得到甲壳低聚糖，避免使用多种酶的反应，降低成本，且可直接得到甲壳低聚糖，但目前采用生物法以废菌体来制备甲壳低聚糖尚未见文献报道。和大分子相比，甲壳低聚糖无毒、易被人体吸收，并具有抗肿瘤、增强免疫力、抗菌、降胆固醇、保湿及促进植物抗逆生长等多种生理功能，在食品、医药、农业等领域有着广泛的应用前景[5，6]。

试验利用柠檬酸发酵工业的黑曲霉废菌体，通过酶法破壁和降解等步骤制备甲壳低聚糖或单糖（本试验以乙酰氨基葡萄糖还原糖为代表），探讨其反应条件，并用红外光谱对破壁后产物的化学结构进行表征，采用铁氰化钾法和乙酰丙酮法测定几丁质酶降解产物中乙酰氨基葡萄糖还原糖（NAG）的含量，确立最佳反应条件。该法制备甲壳低聚糖条件温和，综合利用工厂废菌体，减少环境污染，变废为宝，降低原料成本，同时为再生资源的综合利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

柠檬酸厂发酵废菌体由黄石市兴华生化有限公司提供，破壁所用的蜗牛酶、纤维素酶、溶壁酶购于武汉华顺生物技术有限公司，几丁质酶由本实验室提供。

1.2方法

1.2.1去杂粉碎过40目筛去除废菌体中杂质，并经过反复洗涤至中性，真空干燥或冷冻干燥后，由气流式超细粉碎仪进行粉碎至白色粉末状，保存于干燥器中。

1.2.2酶法破壁

1）破壁方法。称取0.75 g废菌体干样，加入30 mL 0.02 mol/L HOAc-NaOAc缓冲溶液（pH 5.6），加入1%的酶，磁力搅拌下，在50 ℃温水浴中反应5 h后，取出煮沸10～15 min灭酶，8 000 r/min下离心20 min，取上清液采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，并以此考察破壁效果，并以牛血清白蛋白作标样，做3份平行。

2）酶的选择。在0.02 mol/L HOAc-NaOAc缓冲溶液（pH 5.0）中分别加入1%的蜗牛酶、纤维素酶、溶壁酶，50 ℃条件下反应5 h后灭酶，取上清液测蛋白质含量。

3）破壁反应条件。①酶量。分别加入2%、4%、6%、8%的蜗牛酶，50 ℃反应5 h后灭酶，离心取上清液测蛋白质含量。②反应pH。分别加入30 mL pH 4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8的 0.02 mol/L HOAc-NaOAc缓冲溶液，加入4%蜗牛酶，50 ℃反应5 h后灭酶，离心取上清液测蛋白质含量。③反应时间。在50 ℃下分别反应0.5、1、2、3、4、5、6、8 h后灭酶，离心取上清液测蛋白质含量。

1.2.3酶法与超声法结合破壁蜗牛酶50 ℃反应5 h前后，采用超声波破壁，功率400 W，工作时间15 min，间隔6 s。灭酶离心取上清液测蛋白质含量，以单独采用蜗牛酶或超声法破壁的样品为对照。

1.2.4傅里叶红外吸收光谱分析（FT-IR） 取上述离心后的沉淀物冷冻干燥后为破壁产物，研成粉末，样品真空干燥，KBr压片，采用Nicolet AVA2TAR360 FTIR光谱仪扫描，扫描范围400～4 000 cm-1。

1.2.5废菌丝体中几丁质的降解

1）几丁质酶降解。取破壁后产物0.10 g，加入HOAc-NaOAc缓冲溶液（pH 6.0）10 mL，加入10 mg/mL的牛血清白蛋白30 μL，再加入0.1 mg几丁质酶，37 ℃反应6 h，煮沸灭酶，离心取上清液，采用乙酰丙酮法测定降解产物中乙酰氨基葡萄糖还原糖含量[7]。

2）几丁质酶降解条件。①酶量。分别加入0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的几丁质酶，37 ℃反应6 h后灭酶，离心取上清液测定乙酰氨基葡萄糖还原糖含量。②反应温度。加入HOAc-NaOAc缓冲溶液（pH 6.0）10 mL，10 mg/mL的牛血清白蛋白30 μL、0.3%几丁质酶，分别在27、32、37、42、47、52、57 ℃下反应6 h后灭酶，离心取上清液测定乙酰氨基葡萄糖还原糖含量。③反应pH。在10 mL不同pH的HOAc-NaOAc缓冲溶液（pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）中，加入10 mg/mL的牛血清白蛋白 30 μL、0.3%几丁质酶，在37℃下反应6 h后灭酶，离心取上清液测定乙酰氨基葡萄糖还原糖含量。④反应时间。在37 ℃下反应，每隔24 h取一定量的反应液煮沸灭酶，离心取上清液测定乙酰氨基葡萄糖还原糖含量。

2 结果与分析

2.1酶法破壁的最佳反应条件

2.1.1酶的选择酶解破壁使废菌体细胞破碎，胞内产物释放出来，蛋白质也被释放，可以通过测定释放出来的蛋白质含量来比较破壁效果，从而确定酶解破壁条件。真菌细胞壁较厚，结构坚韧，其破壁难度较大。由图1可知，50 ℃反应5 h后，蜗牛酶和纤维素酶破壁后上清中蛋白质含量较溶壁酶的高，破壁效果较好，蜗牛酶破壁效果最好，纤维素酶次之。蜗牛酶是一种以纤维素酶、半纤维素酶等多种酶混合而成的复合酶，因此，蜗牛酶对废菌体细胞壁中复合多糖结构的降解能力较强。

2.1.2酶量不同酶量对蜗牛酶破壁效果的比较如图2所示。随着酶量从2%增加到8%，破壁效果一直呈现明显升高的趋势，但升高幅度先大而后较小。兼顾经济方面的考虑，后面的试验按4%酶量来进行。

2.1.3反应pH不同pH对蜗牛酶破壁的结果如图3所示，随着pH的升高，破壁后蛋白质含量先升高后降低，在pH 5.6时为最大，说明蜗牛酶在pH 5.6时的破壁效果最佳。

2.1.4反应时间不同反应时间对蜗牛酶破壁的结果如图4所示，随着反应时间的延长，蛋白质含量逐渐升高，到4 h以后蛋白质含量趋于平稳，增加到8 h变化不大。说明蜗牛酶破壁反应5 h后已进行得较完全。

2.1.5酶法与超声法结合破壁酶法破壁是一种较温和的破壁方法，因此可将酶法及物理超声法相结合，以期达到最佳破壁效果，结果（图5）表明，单独酶法破壁明显比单独超声破壁效果好，而酶法结合超声的效果和单独酶解的效果较相近，酶+超声法比超声+酶法的效果略好，这更加说明酶法反应5 h已能较完全地进行破壁。

2.2红外光谱表征

图6是废菌体酶法破壁后的产物和商品几丁质的红外谱图。比较两者图谱可以发现，1 577、1 561 cm-1处的吸收峰归属于-NH2的δ（N-H）及酰胺Ⅱ带，1 322、1 361 cm-1处吸收峰归属于酰胺Ⅲ带，1 642、1 645 cm-1处的吸收峰归属于酰胺Ⅰ带，所有酰胺带的出现说明破壁后产物中存在几丁质[8]。而商品几丁质在878 cm-1处有环伸缩振动的吸收峰，显示出几丁质的主链结构，而在破壁后的产物中未出现，只在927、845、545 cm-1处显示出（1-3）-a-D-葡聚糖的特征峰[9，10]，表明废菌体酶法破壁后的主要产物是以（1-3）-a-D-葡聚糖为主链而几丁质结构单元连接在侧链上的复合多糖。

2.3废菌丝体中几丁质降解的最佳条件

18家族内切几丁质酶降解几丁质最终产品为甲壳二糖，采用实验室自制的几丁质酶降解破壁产物6 h后，乙酰丙酮法则可以测定出还原端为乙酰氨基葡萄糖的低聚糖含量为0.15 mg/mL。几丁质酶降解破壁后的多糖复合物产生甲壳二糖外，还可能产生还原端为乙酰氨基葡萄糖或其他还原糖的低聚糖。

2.3.1酶量几丁质含量约为菌体干重的20%～22%，因破壁后产物不全部为几丁质，而是几丁质和葡聚糖的复合物，所以采用不同比例的几丁质酶与破壁产物反应，结果如图7所示。随着酶量的升高，乙酰氨基葡萄糖还原糖含量呈现出先升高后降低的趋势，加入0.3%的几丁质酶得到的NAG含量最高。

2.3.2反应温度在不同温度下，几丁质酶降解废菌丝体破壁产物的结果如图8所示，可以看出，随着温度的升高，产生的几丁质酶降解废菌丝体所产生的乙酰氨基葡萄糖还原糖含量变化趋势不明显，但分别在37 ℃与52 ℃时出现较高值。

2.3.3反应pH不同pH条件下几丁质酶降解废菌丝体破壁产物的结果如图9所示，随着pH的升高，乙酰氨基葡萄糖还原糖含量也随之升高，pH在7～8时达到最高值，随后降低。

2.3.4反应时间不同反应时间几丁质酶与废菌丝体破壁产物反应的结果如图10所示，随着反应时间的增加，乙酰氨基葡萄糖还原糖含量持续增加，反应至7 d后，10 mg废菌丝体破壁后产物可得到乙酰氨基葡萄糖还原糖的质量为0.23 mg，由此可见，该几丁质酶的稳定性较好，可以用于更长时间的酶解反应来提高产率。

3结论

从红外光谱可以看出酶法破壁后得到的废菌体主要产物是（1-3）-a-D-葡聚糖和几丁质的复合物，但几丁质酶可以降解该复合物中的几丁质得到甲壳单糖或低聚糖，10 mg废菌丝体破壁产物加入0.3%几丁质酶降解7 d后乙酰氨基葡萄糖还原糖的质量达到0.23 mg。该方法条件温和，可将黑曲霉废菌体转化为甲壳单糖或低聚糖，不仅变废为宝，降低原料成本，而且减少环境污染，为再生资源的综合利用开辟了新途径。

参考文献：

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[2] 赵继伦，王红林.利用柠檬酸废菌体制备壳聚糖的工艺研究[J].工业微生物，1999，29（2）：33-37.

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2.3废菌丝体中几丁质降解的最佳条件

18家族内切几丁质酶降解几丁质最终产品为甲壳二糖，采用实验室自制的几丁质酶降解破壁产物6 h后，乙酰丙酮法则可以测定出还原端为乙酰氨基葡萄糖的低聚糖含量为0.15 mg/mL。几丁质酶降解破壁后的多糖复合物产生甲壳二糖外，还可能产生还原端为乙酰氨基葡萄糖或其他还原糖的低聚糖。

2.3.1酶量几丁质含量约为菌体干重的20%～22%，因破壁后产物不全部为几丁质，而是几丁质和葡聚糖的复合物，所以采用不同比例的几丁质酶与破壁产物反应，结果如图7所示。随着酶量的升高，乙酰氨基葡萄糖还原糖含量呈现出先升高后降低的趋势，加入0.3%的几丁质酶得到的NAG含量最高。

2.3.2反应温度在不同温度下，几丁质酶降解废菌丝体破壁产物的结果如图8所示，可以看出，随着温度的升高，产生的几丁质酶降解废菌丝体所产生的乙酰氨基葡萄糖还原糖含量变化趋势不明显，但分别在37 ℃与52 ℃时出现较高值。

2.3.3反应pH不同pH条件下几丁质酶降解废菌丝体破壁产物的结果如图9所示，随着pH的升高，乙酰氨基葡萄糖还原糖含量也随之升高，pH在7～8时达到最高值，随后降低。

2.3.4反应时间不同反应时间几丁质酶与废菌丝体破壁产物反应的结果如图10所示，随着反应时间的增加，乙酰氨基葡萄糖还原糖含量持续增加，反应至7 d后，10 mg废菌丝体破壁后产物可得到乙酰氨基葡萄糖还原糖的质量为0.23 mg，由此可见，该几丁质酶的稳定性较好，可以用于更长时间的酶解反应来提高产率。

3结论

从红外光谱可以看出酶法破壁后得到的废菌体主要产物是（1-3）-a-D-葡聚糖和几丁质的复合物，但几丁质酶可以降解该复合物中的几丁质得到甲壳单糖或低聚糖，10 mg废菌丝体破壁产物加入0.3%几丁质酶降解7 d后乙酰氨基葡萄糖还原糖的质量达到0.23 mg。该方法条件温和，可将黑曲霉废菌体转化为甲壳单糖或低聚糖，不仅变废为宝，降低原料成本，而且减少环境污染，为再生资源的综合利用开辟了新途径。

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2.3废菌丝体中几丁质降解的最佳条件

18家族内切几丁质酶降解几丁质最终产品为甲壳二糖，采用实验室自制的几丁质酶降解破壁产物6 h后，乙酰丙酮法则可以测定出还原端为乙酰氨基葡萄糖的低聚糖含量为0.15 mg/mL。几丁质酶降解破壁后的多糖复合物产生甲壳二糖外，还可能产生还原端为乙酰氨基葡萄糖或其他还原糖的低聚糖。

2.3.1酶量几丁质含量约为菌体干重的20%～22%，因破壁后产物不全部为几丁质，而是几丁质和葡聚糖的复合物，所以采用不同比例的几丁质酶与破壁产物反应，结果如图7所示。随着酶量的升高，乙酰氨基葡萄糖还原糖含量呈现出先升高后降低的趋势，加入0.3%的几丁质酶得到的NAG含量最高。

2.3.2反应温度在不同温度下，几丁质酶降解废菌丝体破壁产物的结果如图8所示，可以看出，随着温度的升高，产生的几丁质酶降解废菌丝体所产生的乙酰氨基葡萄糖还原糖含量变化趋势不明显，但分别在37 ℃与52 ℃时出现较高值。

2.3.3反应pH不同pH条件下几丁质酶降解废菌丝体破壁产物的结果如图9所示，随着pH的升高，乙酰氨基葡萄糖还原糖含量也随之升高，pH在7～8时达到最高值，随后降低。

2.3.4反应时间不同反应时间几丁质酶与废菌丝体破壁产物反应的结果如图10所示，随着反应时间的增加，乙酰氨基葡萄糖还原糖含量持续增加，反应至7 d后，10 mg废菌丝体破壁后产物可得到乙酰氨基葡萄糖还原糖的质量为0.23 mg，由此可见，该几丁质酶的稳定性较好，可以用于更长时间的酶解反应来提高产率。

3结论

从红外光谱可以看出酶法破壁后得到的废菌体主要产物是（1-3）-a-D-葡聚糖和几丁质的复合物，但几丁质酶可以降解该复合物中的几丁质得到甲壳单糖或低聚糖，10 mg废菌丝体破壁产物加入0.3%几丁质酶降解7 d后乙酰氨基葡萄糖还原糖的质量达到0.23 mg。该方法条件温和，可将黑曲霉废菌体转化为甲壳单糖或低聚糖，不仅变废为宝，降低原料成本，而且减少环境污染，为再生资源的综合利用开辟了新途径。

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