耐热真菌产木聚糖酶的固体发酵条件
2014-09-22陈功张巍李思佳熊海容
陈功+张巍+李思佳+熊海容
摘要：对嗜热真菌（Thermomyces lanuginosus）DSM 10635的固体培养基进行改良。设计的间歇通气的培养装置，简化掉补水操作后，简化了操作并降低了培养基成本，单瓶玉米芯干粉量为120 g/L，增大了培养瓶的利用率，第5天菌丝已基本充满整个培养体系，同时单批木聚糖酶活力最高为53 710 IU/g。
关键词：木聚糖酶；固体发酵；间歇通气；酶活力
中图分类号：TS201.3；TQ929文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）10-2395-03
Thermostable Xylanase Production with the Solid-state Fementation
CHEN Gong，ZHANG Wei，LI Si-jia，XIONG Hai-rong
（Engineering Research Centre of Bioresource in Southern China，College of Life Science，South-central University for Nationalities，
Wuhan 430074，China）
Abstract：Xylanase production with solid-state fementation of Thermomyces lanuginosus DSM 10635 was optimized. Under the water-saturated aeration device and the optimal culture media， the amount of corncob powder per bottle was 120 g/L. The utilization rate of culture bottle was increased. The mycelium filled up the whole culture system after 5 d and the xylanase productivity was up to 53 710 IU/g.
Key words： ylanases；solid state fermentation； intermittent ventilation； enzyme activity
基金项目：武汉市科技攻关项目（2013020501010180）
木聚糖酶（Xylanase，EC 3.2.1.8）是一种内切β-1，4-木聚糖苷酶。这种酶水解半纤维素中的木聚糖（Xylan）为可代谢的低分子寡聚木糖，对疏松原材料组织结构有重要意义[1-3]。嗜热真菌（Thermomyces lanuginosus）DSM 10635是一种耐热型菌株，所产的木聚糖酶1YNA具有良好的耐热性和热稳定性，能较好地应用于酶法水解木聚糖的高温处理过程[4，5]，能广泛应用于半纤维相关的燃料酒精工业、制浆造纸工业、饲料和食品工业。
目前，已有用基因工程的方法从Thermomyces lanuginosus DSM 10635中提取木聚糖酶基因片段导入毕赤酵母中高效表达和工业化生产的研究[6，7]。但未见有该菌株固体发酵工业化生产的报道。固体发酵有独特的优点，所使用的培养基简单便宜；原料不需糖化液化，处理简单；产物提取容易；固体发酵后的物料可直接作为产物；废水排放量大大减少；单位体积的培养基生产能力高于液体培养基；不易污染杂菌；设备简单等。试验借鉴已报道的最适pH，最适培养温度等条件[8，9]，从适应工业化生产的角度对Thermomyces lanuginosus DSM 10635的固体发酵条件进行改良。
1材料与方法
1.1材料与培养基
1.1.1原料与试剂 玉米芯，菌种为Thermomyces lanuginosus DSM 10635；3，5-二硝基水杨酸（DNS），标准木糖溶液，0.5%木聚糖-磷酸缓冲液（pH 6.5），柠檬酸-磷酸缓冲液（pH 6.5）。其他所用药品均为分析纯。
1.1.2培养基液体种子培养基：马铃薯液体培养基（PDA）；玉米芯固体培养基：将玉米芯粉碎成粉末，称120 g玉米芯干粉于1 L锥形瓶中，按料液比1∶3（g∶mL）添加培养液，在121 ℃下灭菌20 min，静置冷却。
1.2试验方法
1.2.1试验装置试验装置示意图如图1所示。
1.2.2培养基廉价化修改修改后的培养基各成分见表1。
1.2.3培养方法
1）菌种活化。挑取实验室保存的Thermomyces lanuginosus DSM 10635菌种于去离子水中制成悬浮液，并对悬浮液稀释后进行平板涂布，在50 ℃下培养3 d后，置于4 ℃下保藏。
2）种子液的制备。挑取上述平板的单菌落接种于PDA培养基中，于50 ℃ 200 r/min条件下培养3 d，接种于玉米芯固体培养基。
3）固体发酵。每份固体培养基按约10%（V/W）的接种量汇总，放入电控恒温培养箱中50 ℃培养，每隔12 h通气15 min，每隔24 h摇晃锥形瓶一次。
4）培养基含水率的计算。培养7 d后，于超净工作台上从锥形瓶中取出少量培养基，置于相应的干净培养皿中。取样后将锥形瓶放入电控恒温培养箱中继续培养。将盛有样品的培养皿放入电热恒温干燥箱中于60 ℃下烘干约24 h，直至质量不再发生变化，即得到培养皿中培养基的绝干重，并记录其重量以计算含水率。培养第9天重复上述操作。
5）粗酶液的提取。称取烘干后的培养基放入250 mL的锥形瓶，加入100 mL柠檬酸磷酸缓冲液（pH 6.5），放入摇床在160 r/min，50 ℃条件摇瓶10 h，得上清液即为粗酶液。
1.2.4酶活力测定1个国际酶活力单位：在60 ℃和pH 6.5条件下，每分钟水解产生1 μmol还原糖所需酶量，还原糖以木糖为标准，测定酶活力[6]。
2结果与分析
2.1培养基改良后生长状况
图2为培养基改良前后培养5 d后的生长情况，结果表明嗜热真菌DSM 10635在改良后的培养基上生长良好，第5天菌丝已基本充满整个培养体系。
2.2固体发酵失水量记录
在改良后的固体培养体系下，三角瓶内含水率随着培养时间的增加不断降低，发酵7 d后含水率为58%，9 d后含水率为52%（图3），表明培养基瓶口塞加厚棉塞，间歇通入湿润空气的方法，很大程度上保持了培养基含水率，使发酵条件始终处在相对平稳的状态。
2.3酶活力测定结果
由于固体发酵营养成分分布不均一，菌种生长代谢不均一，同等条件下做了3批试验。培养到第7天和第9天时检测酶活力（图4）。由图4可知，3批发酵试验平均酶活力为34 831 IU/g，单批试验最高酶活力达到53 710 IU/g。
3小结与讨论
利用DSM 10635在改良后的培养基上生产木聚糖酶，其酶活力单批最高可提高到53 710 IU/g，这一酶活力也是目前国内较高水平，同时由于同体积的三角瓶中培养基增加了1倍，单瓶产酶能力得以提高。试验设计的间歇通气的固体发酵方法，简化了发酵步骤，培养基的廉价优化降低了培养基成本，这些结果对工业化生产有积极的意义。
利用DSM 10635在改良后的培养基上生产木聚糖酶活力的大幅度提高，原因可能是培养液中添加了少量的葡萄糖以及真菌生长的多种无机盐，使菌株在固体培养基中快速生长和产物积累；间隔通气的试验装置为菌株生长代谢提供了更多的氧气，同时也提高了培养基的传热效率，避免了因代谢产热而导致的局部高温对木聚糖酶活力的影响；每天补水不但加大了试验操作的复杂程度，带来染菌风险，而且会使得固体培养基的营养成分分布不均衡，影响菌株生长，采用在培养瓶口塞加厚棉塞，间歇通入湿润空气的方法，很大程度上保持了培养基含水率，使发酵条件始终处在相对平稳的状态。
参考文献：
[1] XIONG H R，WEYMARN N V，TURUNEN O，et al. Xylanase production by trichoderma reesei rut C-30 grown on L-arabinose-rich plant hydrolysates[J].Bioresource Technology，2005，96（7）：753-759.
[2] SINGH S，MADLALA A M，PRIOR B A. Thermomyces lanuginosus： properties of strains and their hemicellulases[J].FEMS Microbiol Rev ，2003，27（1）：3-16.
[3] 张继泰，曾小英，付正，等.嗜热真菌木聚糖酶与稀酸联合水解甜菜渣生产L-阿拉伯糖的初步研究[J].中南民族大学学报（自然科学版），2009（4）：50-53.
[4] XIONG H R，NYYSSOLA A，JANIS J，et al. Characterization of the xylanase produced by submerged cultivation by Thermomyces lanuginosus DSM 10635[J]. Enzyme and Microbial Technology，2004，35（1）：93-99.
[5] 农旭华，张继泰，王玉瑛，等.嗜热真菌DSM 10635生产耐热木聚糖酶的小试研究[J].工业微生物，2009（3）：62-66.
[6] 李思佳，王亚伟，付正，等.嗜热真菌木聚糖酶 1YNA 及其双硫键突变体在毕赤酵母中的表达[J].中国生物工程杂志，2013，33（3）：74-79.
[7] 江正强，李里特，李颖.耐热木聚糖酶研究进展[J].中国生物工程杂志，2003，23（8）：47-51.
[8] SONIA K G，CHADHA B S，SAINI H S.Sorghum straw for xylanase hyper-production by Thermomyces lanuginosus（D2W3） under solid-state fermentation[J]. Bioresource Technology，2005， 96（14）：1561-1569.
[9] 周薇薇，尹亚辉，赵长新.响应面法优化黑曲霉固态发酵产木聚糖酶工艺[J].大连工业大学学报，2013（3）：176-179.
1.2.4酶活力测定1个国际酶活力单位：在60 ℃和pH 6.5条件下，每分钟水解产生1 μmol还原糖所需酶量，还原糖以木糖为标准，测定酶活力[6]。
2结果与分析
2.1培养基改良后生长状况
图2为培养基改良前后培养5 d后的生长情况，结果表明嗜热真菌DSM 10635在改良后的培养基上生长良好，第5天菌丝已基本充满整个培养体系。
2.2固体发酵失水量记录
在改良后的固体培养体系下，三角瓶内含水率随着培养时间的增加不断降低，发酵7 d后含水率为58%，9 d后含水率为52%（图3），表明培养基瓶口塞加厚棉塞，间歇通入湿润空气的方法，很大程度上保持了培养基含水率，使发酵条件始终处在相对平稳的状态。
2.3酶活力测定结果
由于固体发酵营养成分分布不均一，菌种生长代谢不均一，同等条件下做了3批试验。培养到第7天和第9天时检测酶活力（图4）。由图4可知，3批发酵试验平均酶活力为34 831 IU/g，单批试验最高酶活力达到53 710 IU/g。
3小结与讨论
利用DSM 10635在改良后的培养基上生产木聚糖酶，其酶活力单批最高可提高到53 710 IU/g，这一酶活力也是目前国内较高水平，同时由于同体积的三角瓶中培养基增加了1倍，单瓶产酶能力得以提高。试验设计的间歇通气的固体发酵方法，简化了发酵步骤，培养基的廉价优化降低了培养基成本，这些结果对工业化生产有积极的意义。
利用DSM 10635在改良后的培养基上生产木聚糖酶活力的大幅度提高，原因可能是培养液中添加了少量的葡萄糖以及真菌生长的多种无机盐，使菌株在固体培养基中快速生长和产物积累；间隔通气的试验装置为菌株生长代谢提供了更多的氧气，同时也提高了培养基的传热效率，避免了因代谢产热而导致的局部高温对木聚糖酶活力的影响；每天补水不但加大了试验操作的复杂程度，带来染菌风险，而且会使得固体培养基的营养成分分布不均衡，影响菌株生长，采用在培养瓶口塞加厚棉塞，间歇通入湿润空气的方法，很大程度上保持了培养基含水率，使发酵条件始终处在相对平稳的状态。
参考文献：
[1] XIONG H R，WEYMARN N V，TURUNEN O，et al. Xylanase production by trichoderma reesei rut C-30 grown on L-arabinose-rich plant hydrolysates[J].Bioresource Technology，2005，96（7）：753-759.
[2] SINGH S，MADLALA A M，PRIOR B A. Thermomyces lanuginosus： properties of strains and their hemicellulases[J].FEMS Microbiol Rev ，2003，27（1）：3-16.
[3] 张继泰，曾小英，付正，等.嗜热真菌木聚糖酶与稀酸联合水解甜菜渣生产L-阿拉伯糖的初步研究[J].中南民族大学学报（自然科学版），2009（4）：50-53.
[4] XIONG H R，NYYSSOLA A，JANIS J，et al. Characterization of the xylanase produced by submerged cultivation by Thermomyces lanuginosus DSM 10635[J]. Enzyme and Microbial Technology，2004，35（1）：93-99.
[5] 农旭华，张继泰，王玉瑛，等.嗜热真菌DSM 10635生产耐热木聚糖酶的小试研究[J].工业微生物，2009（3）：62-66.
[6] 李思佳，王亚伟，付正，等.嗜热真菌木聚糖酶 1YNA 及其双硫键突变体在毕赤酵母中的表达[J].中国生物工程杂志，2013，33（3）：74-79.
[7] 江正强，李里特，李颖.耐热木聚糖酶研究进展[J].中国生物工程杂志，2003，23（8）：47-51.
[8] SONIA K G，CHADHA B S，SAINI H S.Sorghum straw for xylanase hyper-production by Thermomyces lanuginosus（D2W3） under solid-state fermentation[J]. Bioresource Technology，2005， 96（14）：1561-1569.
[9] 周薇薇，尹亚辉，赵长新.响应面法优化黑曲霉固态发酵产木聚糖酶工艺[J].大连工业大学学报，2013（3）：176-179.
1.2.4酶活力测定1个国际酶活力单位：在60 ℃和pH 6.5条件下，每分钟水解产生1 μmol还原糖所需酶量，还原糖以木糖为标准，测定酶活力[6]。
2结果与分析
2.1培养基改良后生长状况
图2为培养基改良前后培养5 d后的生长情况，结果表明嗜热真菌DSM 10635在改良后的培养基上生长良好，第5天菌丝已基本充满整个培养体系。
2.2固体发酵失水量记录
在改良后的固体培养体系下，三角瓶内含水率随着培养时间的增加不断降低，发酵7 d后含水率为58%，9 d后含水率为52%（图3），表明培养基瓶口塞加厚棉塞，间歇通入湿润空气的方法，很大程度上保持了培养基含水率，使发酵条件始终处在相对平稳的状态。
2.3酶活力测定结果
由于固体发酵营养成分分布不均一，菌种生长代谢不均一，同等条件下做了3批试验。培养到第7天和第9天时检测酶活力（图4）。由图4可知，3批发酵试验平均酶活力为34 831 IU/g，单批试验最高酶活力达到53 710 IU/g。
3小结与讨论
利用DSM 10635在改良后的培养基上生产木聚糖酶，其酶活力单批最高可提高到53 710 IU/g，这一酶活力也是目前国内较高水平，同时由于同体积的三角瓶中培养基增加了1倍，单瓶产酶能力得以提高。试验设计的间歇通气的固体发酵方法，简化了发酵步骤，培养基的廉价优化降低了培养基成本，这些结果对工业化生产有积极的意义。
利用DSM 10635在改良后的培养基上生产木聚糖酶活力的大幅度提高，原因可能是培养液中添加了少量的葡萄糖以及真菌生长的多种无机盐，使菌株在固体培养基中快速生长和产物积累；间隔通气的试验装置为菌株生长代谢提供了更多的氧气，同时也提高了培养基的传热效率，避免了因代谢产热而导致的局部高温对木聚糖酶活力的影响；每天补水不但加大了试验操作的复杂程度，带来染菌风险，而且会使得固体培养基的营养成分分布不均衡，影响菌株生长，采用在培养瓶口塞加厚棉塞，间歇通入湿润空气的方法，很大程度上保持了培养基含水率，使发酵条件始终处在相对平稳的状态。
参考文献：
[1] XIONG H R，WEYMARN N V，TURUNEN O，et al. Xylanase production by trichoderma reesei rut C-30 grown on L-arabinose-rich plant hydrolysates[J].Bioresource Technology，2005，96（7）：753-759.
[2] SINGH S，MADLALA A M，PRIOR B A. Thermomyces lanuginosus： properties of strains and their hemicellulases[J].FEMS Microbiol Rev ，2003，27（1）：3-16.
[3] 张继泰，曾小英，付正，等.嗜热真菌木聚糖酶与稀酸联合水解甜菜渣生产L-阿拉伯糖的初步研究[J].中南民族大学学报（自然科学版），2009（4）：50-53.
[4] XIONG H R，NYYSSOLA A，JANIS J，et al. Characterization of the xylanase produced by submerged cultivation by Thermomyces lanuginosus DSM 10635[J]. Enzyme and Microbial Technology，2004，35（1）：93-99.
[5] 农旭华，张继泰，王玉瑛，等.嗜热真菌DSM 10635生产耐热木聚糖酶的小试研究[J].工业微生物，2009（3）：62-66.
[6] 李思佳，王亚伟，付正，等.嗜热真菌木聚糖酶 1YNA 及其双硫键突变体在毕赤酵母中的表达[J].中国生物工程杂志，2013，33（3）：74-79.
[7] 江正强，李里特，李颖.耐热木聚糖酶研究进展[J].中国生物工程杂志，2003，23（8）：47-51.
[8] SONIA K G，CHADHA B S，SAINI H S.Sorghum straw for xylanase hyper-production by Thermomyces lanuginosus（D2W3） under solid-state fermentation[J]. Bioresource Technology，2005， 96（14）：1561-1569.
[9] 周薇薇，尹亚辉，赵长新.响应面法优化黑曲霉固态发酵产木聚糖酶工艺[J].大连工业大学学报，2013（3）：176-179.
