宽筋藤多糖的提取纯化

王庶+文慧+姚晶+卢永昌

摘要：对宽筋藤（Tinospora sinensis）多糖进行提取纯化研究，采用正交试验确定了影响宽筋藤多糖的提取因素主次顺序为提取温度、提取时间、料液比，即在提取温度为90 ℃，提取90 min，料液比1∶10（m/V， g∶mL）的条件下提取，宽筋藤粗多糖提取率为3.94%，其中还原性多糖含量为20.40%，蛋白质含量为8.21%；去除蛋白质的方法中TCA法最适宜宽筋藤粗多糖的纯化，能去除86.83%的蛋白质，还原性多糖保留率为68.67%。

关键词：宽筋藤（Tinospora sinensis）；多糖；蛋白质；TCA法

中图分类号：R284.2；O657.32文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）10-2389-03

Extraction and Purification of Tinospora sinensis Polysaccharide

WANG Shu，WEN Hui，YAO Jing，LU Yong-chang

（College of Chemistry and Life Sciences，Qinghai University for Nationalities，Xining 810007，China）

Abstract： To study the extraction and purification of the polysaccharide from Tinospora sinensis，the extraction temperature， extraction timeand solid-liquid ratio was determined by phenol-sulfuric acid method. The optimal conditions were temperature 90 ℃， extracting 90 min twice with solid-liquid ratio 1∶10. The extraction rate of polysaccharide from Tinospora sinensis was 3.94%. The content of polysaccharide was 20.40%. The content of protein was 8.21%. The removal rate of protein was 86.83% and the retention rate of polysaccharide was 68.67% by TCA method.

Key words： Tinospora sinensis； polysaccharides； protein； TCA method

基金项目：青海省科技厅国际交流项目（2012-H-811）

宽筋藤（Tinospora sinensis）为防己科青牛胆属植物中华青牛胆（Tinospora sinensis）的茎，是藏药中的常用药材。藏药药典《晶珠本草》中记载，其功效为清除隆热症[1，2]。多糖是构成生命的基本物质之一，近年来大量研究表明，植物多糖具有提高机体免疫功能，抗肿瘤，抗病毒，抗凝血，抗衰老等作用[3-10]。目前关于宽筋藤多糖的提取纯化研究鲜见报道，本研究通过正交试验设计探讨了宽筋藤多糖的最佳提取条件，比较了Sevag法、TCA法，TCA-正丁醇法等对宽筋藤粗多糖中蛋白质的去除效果，为宽筋藤多糖的进一步研究和开发利用打好基础。

1材料与方法

1.1仪器、试剂与材料

T6型新锐可见分光光度计（北京普析通用仪器）；KQ-300B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；SHBIII型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），EYELA-N1100型旋转蒸发仪（上海爱明仪器有限公司），TD3型低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

葡萄糖，牛血清白蛋白，苯酚，硫酸，考马斯亮蓝G，磷酸，无水乙醇，氯化钠，三氯乙酸，正丁醇，氯仿均为分析纯。

宽筋藤于2012年9月采自青海省互助北山，经青海民族大学化学与生命科学学院毛继祖教授鉴定为藏药宽筋藤。

1.2方法

1.2.1比色法测定还原性多糖及蛋白质标准曲线

1）标准溶液的配制。精确称取经105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.100 0 g定容至100 mL容量瓶中，得1 mg/mL葡萄糖标准溶液，从中准确移取10 mL定容至100 mL，得0.1 mg/mL葡萄糖标准操作液。

精密称取0.100 0 g牛血清白蛋白，用0.15 mol/L NaCl溶液定容至100 mL容量瓶中，得1 mg/mL蛋白质标准溶液，从中准确移取10 mL定容至100 mL，得0.1 mg/mL蛋白质标准操作液。

2）还原性多糖标准曲线的测定。采用苯酚-硫酸法，分别移取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mL葡萄糖标准操作液置于10 mL容量瓶中并用去离子水补充至1 mL，加入2 mL 5%苯酚溶液，用98%浓硫酸定容至10 mL，摇匀，沸水浴加热20 min后冷却至室温。以0 mL空白对照作为参比溶液，用1 cm比色皿在490 nm处测定吸光度A，以吸光度A为纵坐标，葡萄糖浓度c为横坐标，得到回归方程为Y（A）=0.009+6.002X（c），R2=0.998 4。结果表明，葡萄糖在0.01～0.10 mg/mL 范围内呈良好的线性关系。

3）蛋白质标准曲线的测定。采用考马斯亮蓝法，分别移取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL蛋白质标准操作液置于10 mL容量瓶中并用0.15 mol/L NaCl溶液补充至1 mL，加入5 mL考马斯亮蓝溶液（称取100 mg考马斯亮蓝溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用去离子水定容至1 L），静置10 min。以0 mL空白对照作为参比溶液，用1 cm比色皿，在595 nm处测定吸光度A，以吸光度A为纵坐标，蛋白质浓度c为横坐标，得到回归方程为Y（A）=0.002+6.084X（c），R2=0.995 3。结果表明，蛋白质在0.01～0.10 mg/mL 范围内呈良好的线性关系。

1.2.2宽筋藤多糖的提取及含量测定准确称取10.00 g宽筋藤粉末，用100 mL石油醚超声脱脂2次，过滤，加入100 mL去离子水在90 ℃下热回流提取90 min，提取两次，过滤，合并两次滤液并浓缩至30 mL，加入70 mL无水乙醇，静置8 h，过滤得宽筋藤粗多糖。粗多糖提取率按公式（1）计算。

粗多糖提取率=×100%（1）

其中，m1为过滤所得粗多糖质量，m2为取用宽筋藤药材质量。

将宽筋藤粗多糖重新溶解并定容至250 mL，移取0.10 mL置于10 mL容量瓶中并用去离子水补充至1 mL，加入2 mL 5%苯酚溶液，用98%浓硫酸定容至10 mL。以空白对照为参比溶液，用1 cm比色皿在490 nm处测定吸光度A。宽筋藤还原性多糖含量按公式（2）计算。

宽筋藤还原性多糖含量=（2）

其中，A1为吸光度，V1为稀释体积。

移取上述0.50 mL宽筋藤粗多糖溶液液置于10 mL容量瓶中并用0.15 mol/L NaCl溶液补充至1 mL，加入5 mL考马斯亮蓝溶液静置10 min。以0 mL空白对照作为参比溶液，用1 cm比色皿，在595 nm处测定吸光度A2。宽筋藤蛋白质含量按公式（3）计算。

宽筋藤蛋白质含量= （3）

其中，A2为吸光度，V2为稀释体积。

1.2.3正交试验设计选择提取温度，提取时间，料液比作为考察因素，各因素下设3个水平（表1），按L9（34）设计正交试验，以还原性多糖质量作为标准确定最佳提取条件。

1.2.4Sevag法等对宽筋藤粗多糖中蛋白质的去除

1）称取0.203 4 g宽筋藤粗多糖粉末定容至200 mL容量瓶中，测定其中还原性多糖与蛋白质质量。

2）Sevag法去除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL氯仿、1 mL正丁醇混合液进行萃取操作，分液，重复6次，将水相浓缩后重新用去离子水定容至25 mL容量瓶中，测定其中还原性多糖与蛋白质质量。

3）TCA法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入25 mL 10%三氯乙酸溶液，静置一夜，离心去除沉淀，将溶液浓缩后重新用去离子水定容至25 mL容量瓶中，测定其中还原性多糖与蛋白质质量。

4）TCA-正丁醇法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL 10%三氯乙酸溶液、20 mL正丁醇混合液进行萃取操作，分液，将水相浓缩后重新用去离子水定容至25 mL容量瓶中，测定其中还原性多糖与蛋白质质量。

蛋白质去除率=×100%

其中，m1为宽筋藤粗多糖中总蛋白质的质量，m2为去除蛋白质后宽筋藤粗多糖中蛋白质的质量。

还原性多糖保留率=×100%

其中，m3为宽筋藤粗多糖中还原性多糖的质量，m4为去除蛋白质后宽筋藤粗多糖中还原性多糖的质量。

2结果与分析

2.1宽筋藤多糖的最佳提取条件

正交试验结果见表2。由表2可知各因素对多糖提取率的影响依次为提取温度、提取时间、料液比（m/V，g：mL）。最佳提取组合为A3B3C2，即提取温度90 ℃、提取时间90 min、料液比1∶10，此条件下宽筋藤粗多糖提取率为3.94%，其中还原性多糖含量为20.40%，蛋白质含量为8.21%。

2.2Sevag法等对宽筋藤多糖中蛋白质的去除效果

未除去蛋白质的宽筋藤粗多糖溶液中还原性多糖含量为20.40%，蛋白质含量为8.21%。Sevag法处理宽筋藤粗多糖溶液6次后，蛋白质去除率为43.11%，还原性多糖保留率为83.86%；TCA法处理宽筋藤粗多糖溶液后，蛋白质去除率为86.83%，还原性多糖保留率为68.67%；TCA-正丁醇法处理宽筋藤粗多糖溶液后，蛋白质去除率为56.29%，还原性多糖保留率为65.06%。试验结果表明，TCA-正丁醇法去除蛋白质效果较差，多糖保留率也较低。Sevag法虽多糖保留较多，但去除蛋白质效果较差，且操作繁琐。TCA法能有效去除宽筋藤粗多糖中的蛋白质，相对多的保留多糖组分，操作简单。

3小结

试验确定了宽筋藤多糖的最优提取条件，即提取温度90 ℃、提取时间90 min、料液比1∶10，此条件下宽筋藤粗多糖的提取率为3.94%，其中还原性多糖含量为20.40%，蛋白质含量为8.21%。去除蛋白质的方法中TCA法最适宜宽筋藤粗多糖的纯化，能去除86.83%的蛋白质，还原性多糖保留率68.67%。

参考文献：

[1] 帝玛尔·丹增彭措.晶珠本草[M].毛继祖，译.上海：上海科学技术出版社，2012.329.

[2] 钟 文，翟 瑶，卢永昌.藏药宽筋藤中总黄酮和芦丁含量的测定[J].湖北农业科学，2013，52（9）：2151-2152，2170.

[3] 孙文平.三种药用植物类水溶性多糖对小鼠免疫调节作用及其规律的研究[D].辽宁大连：大连医科大学，2006.

[4] ZHU X L， CHEN A F， LIN Z B. Ganoderma lucidum polysaccharides enhance the function of immunological effector cells in immunosuppressed mice[J]. Journal of Ethnopharmacology，2007，111（2）：219-226.

[5] 赵俊霞.刺五加多糖对人小细胞肺癌H446细胞的抑制作用及免疫调节作用研究[D].石家庄：河北医科大学，2008.

[6] CHEN H，QI X D.Study on the effect of polysaccharides from solanum nigrum linne on cellular immune function in tumour-bearing mice[J].Afr J TraditComplement Altern Med，2013，10 （4）：41-46.

[7] 张红英.3种植物多糖抗猪蓝耳病病毒及免疫增强作用研究[D].郑州：河南农业大学，2007.

[8] 高秀妹.四种植物多糖抑菌抗病毒作用及其对波氏杆菌免疫增强作用的比较研究[D].山东泰安：山东农业大学，2012.

[9] 冯以明.四种绿藻多糖的提取分离及其结构与抗凝活性研究[D].山东青岛：中国海洋大学，2012.

[10] CAI W R，XIE L L，CHEN Y，et al.Purification，characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea[J].Carbohydrate Polymers，2013，92（2）：1086-1090.

1.2.2宽筋藤多糖的提取及含量测定准确称取10.00 g宽筋藤粉末，用100 mL石油醚超声脱脂2次，过滤，加入100 mL去离子水在90 ℃下热回流提取90 min，提取两次，过滤，合并两次滤液并浓缩至30 mL，加入70 mL无水乙醇，静置8 h，过滤得宽筋藤粗多糖。粗多糖提取率按公式（1）计算。

粗多糖提取率=×100%（1）

其中，m1为过滤所得粗多糖质量，m2为取用宽筋藤药材质量。

将宽筋藤粗多糖重新溶解并定容至250 mL，移取0.10 mL置于10 mL容量瓶中并用去离子水补充至1 mL，加入2 mL 5%苯酚溶液，用98%浓硫酸定容至10 mL。以空白对照为参比溶液，用1 cm比色皿在490 nm处测定吸光度A。宽筋藤还原性多糖含量按公式（2）计算。

宽筋藤还原性多糖含量=（2）

其中，A1为吸光度，V1为稀释体积。

移取上述0.50 mL宽筋藤粗多糖溶液液置于10 mL容量瓶中并用0.15 mol/L NaCl溶液补充至1 mL，加入5 mL考马斯亮蓝溶液静置10 min。以0 mL空白对照作为参比溶液，用1 cm比色皿，在595 nm处测定吸光度A2。宽筋藤蛋白质含量按公式（3）计算。

宽筋藤蛋白质含量= （3）

其中，A2为吸光度，V2为稀释体积。

1.2.3正交试验设计选择提取温度，提取时间，料液比作为考察因素，各因素下设3个水平（表1），按L9（34）设计正交试验，以还原性多糖质量作为标准确定最佳提取条件。

1.2.4Sevag法等对宽筋藤粗多糖中蛋白质的去除

1）称取0.203 4 g宽筋藤粗多糖粉末定容至200 mL容量瓶中，测定其中还原性多糖与蛋白质质量。

2）Sevag法去除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL氯仿、1 mL正丁醇混合液进行萃取操作，分液，重复6次，将水相浓缩后重新用去离子水定容至25 mL容量瓶中，测定其中还原性多糖与蛋白质质量。

3）TCA法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入25 mL 10%三氯乙酸溶液，静置一夜，离心去除沉淀，将溶液浓缩后重新用去离子水定容至25 mL容量瓶中，测定其中还原性多糖与蛋白质质量。

4）TCA-正丁醇法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL 10%三氯乙酸溶液、20 mL正丁醇混合液进行萃取操作，分液，将水相浓缩后重新用去离子水定容至25 mL容量瓶中，测定其中还原性多糖与蛋白质质量。

蛋白质去除率=×100%

其中，m1为宽筋藤粗多糖中总蛋白质的质量，m2为去除蛋白质后宽筋藤粗多糖中蛋白质的质量。

还原性多糖保留率=×100%

其中，m3为宽筋藤粗多糖中还原性多糖的质量，m4为去除蛋白质后宽筋藤粗多糖中还原性多糖的质量。

2结果与分析

2.1宽筋藤多糖的最佳提取条件

正交试验结果见表2。由表2可知各因素对多糖提取率的影响依次为提取温度、提取时间、料液比（m/V，g：mL）。最佳提取组合为A3B3C2，即提取温度90 ℃、提取时间90 min、料液比1∶10，此条件下宽筋藤粗多糖提取率为3.94%，其中还原性多糖含量为20.40%，蛋白质含量为8.21%。

2.2Sevag法等对宽筋藤多糖中蛋白质的去除效果

未除去蛋白质的宽筋藤粗多糖溶液中还原性多糖含量为20.40%，蛋白质含量为8.21%。Sevag法处理宽筋藤粗多糖溶液6次后，蛋白质去除率为43.11%，还原性多糖保留率为83.86%；TCA法处理宽筋藤粗多糖溶液后，蛋白质去除率为86.83%，还原性多糖保留率为68.67%；TCA-正丁醇法处理宽筋藤粗多糖溶液后，蛋白质去除率为56.29%，还原性多糖保留率为65.06%。试验结果表明，TCA-正丁醇法去除蛋白质效果较差，多糖保留率也较低。Sevag法虽多糖保留较多，但去除蛋白质效果较差，且操作繁琐。TCA法能有效去除宽筋藤粗多糖中的蛋白质，相对多的保留多糖组分，操作简单。

3小结

试验确定了宽筋藤多糖的最优提取条件，即提取温度90 ℃、提取时间90 min、料液比1∶10，此条件下宽筋藤粗多糖的提取率为3.94%，其中还原性多糖含量为20.40%，蛋白质含量为8.21%。去除蛋白质的方法中TCA法最适宜宽筋藤粗多糖的纯化，能去除86.83%的蛋白质，还原性多糖保留率68.67%。

参考文献：

[1] 帝玛尔·丹增彭措.晶珠本草[M].毛继祖，译.上海：上海科学技术出版社，2012.329.

[2] 钟 文，翟 瑶，卢永昌.藏药宽筋藤中总黄酮和芦丁含量的测定[J].湖北农业科学，2013，52（9）：2151-2152，2170.

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[6] CHEN H，QI X D.Study on the effect of polysaccharides from solanum nigrum linne on cellular immune function in tumour-bearing mice[J].Afr J TraditComplement Altern Med，2013，10 （4）：41-46.

[7] 张红英.3种植物多糖抗猪蓝耳病病毒及免疫增强作用研究[D].郑州：河南农业大学，2007.

[8] 高秀妹.四种植物多糖抑菌抗病毒作用及其对波氏杆菌免疫增强作用的比较研究[D].山东泰安：山东农业大学，2012.

[9] 冯以明.四种绿藻多糖的提取分离及其结构与抗凝活性研究[D].山东青岛：中国海洋大学，2012.

[10] CAI W R，XIE L L，CHEN Y，et al.Purification，characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea[J].Carbohydrate Polymers，2013，92（2）：1086-1090.

1.2.2宽筋藤多糖的提取及含量测定准确称取10.00 g宽筋藤粉末，用100 mL石油醚超声脱脂2次，过滤，加入100 mL去离子水在90 ℃下热回流提取90 min，提取两次，过滤，合并两次滤液并浓缩至30 mL，加入70 mL无水乙醇，静置8 h，过滤得宽筋藤粗多糖。粗多糖提取率按公式（1）计算。

粗多糖提取率=×100%（1）

其中，m1为过滤所得粗多糖质量，m2为取用宽筋藤药材质量。

将宽筋藤粗多糖重新溶解并定容至250 mL，移取0.10 mL置于10 mL容量瓶中并用去离子水补充至1 mL，加入2 mL 5%苯酚溶液，用98%浓硫酸定容至10 mL。以空白对照为参比溶液，用1 cm比色皿在490 nm处测定吸光度A。宽筋藤还原性多糖含量按公式（2）计算。

宽筋藤还原性多糖含量=（2）

其中，A1为吸光度，V1为稀释体积。

移取上述0.50 mL宽筋藤粗多糖溶液液置于10 mL容量瓶中并用0.15 mol/L NaCl溶液补充至1 mL，加入5 mL考马斯亮蓝溶液静置10 min。以0 mL空白对照作为参比溶液，用1 cm比色皿，在595 nm处测定吸光度A2。宽筋藤蛋白质含量按公式（3）计算。

宽筋藤蛋白质含量= （3）

其中，A2为吸光度，V2为稀释体积。

1.2.3正交试验设计选择提取温度，提取时间，料液比作为考察因素，各因素下设3个水平（表1），按L9（34）设计正交试验，以还原性多糖质量作为标准确定最佳提取条件。

1.2.4Sevag法等对宽筋藤粗多糖中蛋白质的去除

1）称取0.203 4 g宽筋藤粗多糖粉末定容至200 mL容量瓶中，测定其中还原性多糖与蛋白质质量。

2）Sevag法去除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL氯仿、1 mL正丁醇混合液进行萃取操作，分液，重复6次，将水相浓缩后重新用去离子水定容至25 mL容量瓶中，测定其中还原性多糖与蛋白质质量。

3）TCA法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入25 mL 10%三氯乙酸溶液，静置一夜，离心去除沉淀，将溶液浓缩后重新用去离子水定容至25 mL容量瓶中，测定其中还原性多糖与蛋白质质量。

4）TCA-正丁醇法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL 10%三氯乙酸溶液、20 mL正丁醇混合液进行萃取操作，分液，将水相浓缩后重新用去离子水定容至25 mL容量瓶中，测定其中还原性多糖与蛋白质质量。

蛋白质去除率=×100%

其中，m1为宽筋藤粗多糖中总蛋白质的质量，m2为去除蛋白质后宽筋藤粗多糖中蛋白质的质量。

还原性多糖保留率=×100%

其中，m3为宽筋藤粗多糖中还原性多糖的质量，m4为去除蛋白质后宽筋藤粗多糖中还原性多糖的质量。

2结果与分析

2.1宽筋藤多糖的最佳提取条件

正交试验结果见表2。由表2可知各因素对多糖提取率的影响依次为提取温度、提取时间、料液比（m/V，g：mL）。最佳提取组合为A3B3C2，即提取温度90 ℃、提取时间90 min、料液比1∶10，此条件下宽筋藤粗多糖提取率为3.94%，其中还原性多糖含量为20.40%，蛋白质含量为8.21%。

2.2Sevag法等对宽筋藤多糖中蛋白质的去除效果

未除去蛋白质的宽筋藤粗多糖溶液中还原性多糖含量为20.40%，蛋白质含量为8.21%。Sevag法处理宽筋藤粗多糖溶液6次后，蛋白质去除率为43.11%，还原性多糖保留率为83.86%；TCA法处理宽筋藤粗多糖溶液后，蛋白质去除率为86.83%，还原性多糖保留率为68.67%；TCA-正丁醇法处理宽筋藤粗多糖溶液后，蛋白质去除率为56.29%，还原性多糖保留率为65.06%。试验结果表明，TCA-正丁醇法去除蛋白质效果较差，多糖保留率也较低。Sevag法虽多糖保留较多，但去除蛋白质效果较差，且操作繁琐。TCA法能有效去除宽筋藤粗多糖中的蛋白质，相对多的保留多糖组分，操作简单。

3小结

试验确定了宽筋藤多糖的最优提取条件，即提取温度90 ℃、提取时间90 min、料液比1∶10，此条件下宽筋藤粗多糖的提取率为3.94%，其中还原性多糖含量为20.40%，蛋白质含量为8.21%。去除蛋白质的方法中TCA法最适宜宽筋藤粗多糖的纯化，能去除86.83%的蛋白质，还原性多糖保留率68.67%。

参考文献：

[1] 帝玛尔·丹增彭措.晶珠本草[M].毛继祖，译.上海：上海科学技术出版社，2012.329.

[2] 钟 文，翟 瑶，卢永昌.藏药宽筋藤中总黄酮和芦丁含量的测定[J].湖北农业科学，2013，52（9）：2151-2152，2170.

[3] 孙文平.三种药用植物类水溶性多糖对小鼠免疫调节作用及其规律的研究[D].辽宁大连：大连医科大学，2006.

[4] ZHU X L， CHEN A F， LIN Z B. Ganoderma lucidum polysaccharides enhance the function of immunological effector cells in immunosuppressed mice[J]. Journal of Ethnopharmacology，2007，111（2）：219-226.

[5] 赵俊霞.刺五加多糖对人小细胞肺癌H446细胞的抑制作用及免疫调节作用研究[D].石家庄：河北医科大学，2008.

[6] CHEN H，QI X D.Study on the effect of polysaccharides from solanum nigrum linne on cellular immune function in tumour-bearing mice[J].Afr J TraditComplement Altern Med，2013，10 （4）：41-46.

[7] 张红英.3种植物多糖抗猪蓝耳病病毒及免疫增强作用研究[D].郑州：河南农业大学，2007.

[8] 高秀妹.四种植物多糖抑菌抗病毒作用及其对波氏杆菌免疫增强作用的比较研究[D].山东泰安：山东农业大学，2012.

[9] 冯以明.四种绿藻多糖的提取分离及其结构与抗凝活性研究[D].山东青岛：中国海洋大学，2012.

[10] CAI W R，XIE L L，CHEN Y，et al.Purification，characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea[J].Carbohydrate Polymers，2013，92（2）：1086-1090.