天麻种子自然萌发和生长特性

冉孝琴+桂阳+张丽娜+杨通静+朱国胜

摘要：为了揭示乌天麻和红天麻种子自然萌发和生长发育特性，建立野生萌发菌收集方法，采用4 ℃冷藏、室温贮藏、新鲜种子3种不同贮藏方式的红天麻和乌天麻种子在原生地播种，通过不同时间取样，观察统计种子的萌发率、死亡率和萌发生长指数。结果表明，天麻种子6月播种，8月有较高的萌发率，9月种子萌发生长指数高；不同贮藏方式下的天麻种子其萌发率、死亡率、生长指数差异显著；常温贮藏种子萌发生长指数显著小于4 ℃冷藏种子与新鲜种子，4 ℃冷藏种子与新鲜种子之间萌发生长指数相近。因此在6月选择新鲜种子或短时间冷藏种子播种有利于种子的萌发，在9月利于采样，可以获得理想的萌发菌分离材料。

关键词：天麻（Gastrodia elata）；萌发菌；原生地；萌发率；萌发生长指数

中图分类号：S682.31；Q945.34文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）10-2325-05

The Natural Germination-Growth Characteristics of Gastrodia elata Seeds

RAN Xiao-qin1，2，GUI Yang2，ZHANG Li-na2，YANG Tong-jing2，ZHU Guo-sheng2

（1.College of Life Science，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China； 2.Institute of Modern Chinese Medicinal Materials，Guizhou Academy of Agricultural Sciences/Guizhou Key Laboratory of Agricultural Biotechnology，Guiyang 550006，China）

Abstract： To reveal the seed germination and growing characteristics of seeds of G. elata f.elata and G.elata f.glauca S.Chow and to establish the wild G. elata germinating fungi collection method， fresh seeds and seeds preservted under 4 ℃ or room temperature of G.elata f.elata and G.elata f.glauca S.Chow were sowned and sampled in situ. Methods of observation and statistics were used to study seed mortality rate，germination rate and germination-growth index.Results showed that seeds sowned in June had higher seed germination rate in August and higher germination- growth index in September.There were significant differences of germination rate，mortality rate and germination-growth index among seeds stored under three different temperature. Germination-growth index of seeds stored under room temperature was significant lower than that of fresh seeds and those stored under 4 ℃. There was no significant difference of germination-growth index between fresh seed and those stored under 4 ℃. Fresh seeds and seeds stored under 4 ℃ for 20 days were used to sow in June，good germinating fungi separation material could be collected in September.

Key words： Gastrodia elata；germinating fungi；in situ；germination rate；germination-growth index

基金项目：贵州省优秀青年科技人才培养对象专项资金项目[黔科合人字（2011）35号]；贵州省科技计划项目[黔科合院所创能（2010）4002]；贵州省农业科学院博士科研启动项目[黔农科院人才启动项目（2009）006号]

天麻（Gastrodia elata）为兰科天麻属（Gastrodia）多年生寄生草本，无根，无绿色叶片，不能进行光合作用，营异养生活[1]。天麻全世界约有20种以上，分布于热带、亚热带、温带以及寒温带山地[2]。中国天麻属植物已发现6个种，即天麻（G. elata）、原天麻（G. angusta）、细天麻（G. gracilis）、南天麻（G. javanica）、疣天麻（G. tuberculata）。天麻在西南地区大多生长于海拔700～2 800 m的阔叶落叶林山区[3，4]。天麻干燥块茎具有平肝熄风、止痉之功效，用于治疗头晕目眩、小儿惊风、癫痫、肢体麻木及半身不遂等症[5，6]。近年来的研究发现，天麻还具有增智、健脑和延缓衰老的作用，对老年性痴呆症具有一定的疗效[7，8]。因此，天麻越来越受到人们的关注。

由于生态环境的不断破坏和人类大肆采挖，使得野生天麻资源日益减少，目前天麻已被列入国家重点保护野生植物名录。天麻在中国普遍栽培，红天麻和乌天麻为主栽品种。天麻种子小，发育不全，没有胚乳，自身贮存的营养不能满足其萌发和生长需要，需与小菇属真菌共生才能正常萌发生长形成原球茎，但不同的小菇属真菌对天麻种子萌发和生长的作用差异较大[9，10]。贵州省农业生物技术重点实验室人员在贵州天麻产区的调查结果也表明，不同天麻种子与不同萌发菌之间的亲和性不同，同种萌发菌对同种天麻种子萌发和生长效果还受自然环境的影响，在实际生产中往往因萌发菌菌种与当地天麻种子的亲和性不高或不适宜当地的生态环境而导致空窝率高，最终影响到天麻有性繁殖的产量，很多产地不得不通过增加种子的数量来降低风险，每平方米用种量最多的可达到25个蒴果，大大增加了成本[11]。为此搜集不同天麻产区萌发菌资源，选育出适宜不同区域不同种天麻的高亲和性萌发菌菌株已成为减少蒴果用量、降低成本、提高效益的必由之路。Rasmussen等[12]建立的种子袋原生地播种技术使得回收微小兰科植物种子成为可能，为兰科植物种子在自然界中萌发特性研究提供了技术保障。目前，种子袋原生地播种法已成功应用于多种兰科植物种子自然萌发特性的研究，定期回收种子袋检测种子的萌发情况，可调查种子的萌发启动时间、种子萌发形态变化过程及种子在土壤中的存活时期[13-15]；可调查种子萌发与地点分布的相关性[16-18]；可诱捕共生菌，调查种子萌发与共生菌的相关性[19-21]。迄今为止，还没有关于天麻种子原生地自然萌发特性和利用种子袋原生地共生萌发诱捕野生萌发菌的相关报道。本研究采用原生地种子袋播种法，将不同贮藏方式的天麻种子在原生地播种，并在不同时间取样观察种子萌发生长变化情况，总结出天麻种子自然萌发和生长发育特性，建立野生萌发菌收集方法。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料分别为红天麻与乌天麻。采集授粉后20～21 d的蒴果，红天麻蒴果颜色为橙红色，乌天麻蒴果的颜色为橙黄色，成熟蒴果的六条纵缝明显，手捏起来有点软，可听见微弱开裂的声音。

1.2试验设计

试验设置3种不同的种子贮藏方式，以考察不同贮藏方式对种子播种后的影响，各贮藏方式分别为：①4 ℃冷藏种子。每种天麻各100粒蒴果，每25粒蒴果装1信封中，蒴果开裂后，将果壳取出，信封不封口，放入冰箱4 ℃冷藏20 d备用。②常温贮藏种子。同4 ℃冷藏种子采集方法，每25粒放在一个平皿内，蒴果采下来一天就会开裂，开裂后将蒴果壳拿出，防止霉变，放置20 d备用。③新鲜种子。采集蒴果，不贮藏，立即用。

1.3试验方法

1.3.1播种前种子质量的检测将4 ℃冷藏、室温贮藏和新鲜的天麻种子分别取出，各自混合均匀，取适量种子加入1.5 mL离心管中的0.25 mL刻度处，加入1%TTC溶液1 mL，30 ℃黑暗静置48 h后，用胶头滴管吹打使种子混匀，混匀后吸取种子滴在载玻片中央，用吸水纸吸去染液，置于体视显微镜下，随机挑选3个视野，观察种子染色情况，有活力种子种胚被染成橙色或者粉红色，无活力种子种胚不着色或染成黄色，分别计数每个视野的种子总数和有活力种子总数，并计算种子活力。种子活力=（有活力种子总数/统计种子总数）×100%[22]。每个样品设3次重复。

1.3.2原生地播种参考原生地播种法[12]，采用300目尼龙网（孔径约为20 μm）制作成7 cm×8 cm网袋，一端开口，播种前分别将种子袋在去离子水中浸泡5 min，将蒴果种子混合均匀后，用小勺把种子从网袋开口端撒入，稀疏平铺种子袋一层，约为1 000粒种子。于2012年6月24日在天麻野生分布区贵州省雷山县方祥乡落叶阔叶林中（108°12′50″E，26°25′59″N，海拔1 598.60 m，阳坡坡度5°～10°）进行播种。将种子装好后，扒开浅层腐殖土及落叶，到落叶与地面土壤接触的那一层时，将种子袋水平铺开，覆盖腐殖土约15 cm，然后再盖10 cm杂草保湿保温。

1.3.3数据统计与分析于2012年8月27日、9月20日、10月23日、11月19日、12月22日进行取样，将取出的种子袋装入有泥土的袋子中带回实验室观察。观察时先用毛刷刷去种子袋表面泥土，打开种子袋置于体式镜下，随机挑选5个视野，分别计算每个视野的种子总数、死亡种子总数和萌发种子总数，并计算萌发率、死亡率和萌发生长指数。萌发率=（萌发种子总数/统计种子总数）×100%；死亡率=（死亡种子总数/统计种子总数）×100%；萌发生长指数=（N1+2N2+3N3+4N4）/（N0+N1+N2+N3+N4），其中N0是未萌发种子数，N1、N2、N3、N4是种子萌发阶段1、2、3、4的种子数[23]。萌发生长指数能够反映种子萌发后各阶段原球茎的生长情况。运用SPSS 17.0软件对统计数据进行单因素方差分析，分析各因子对天麻种子自然萌发和生长的影响。

2结果与分析

2.1不同贮藏方式对天麻种子活力的影响

经过TTC染色检测有效种胚种子的活力，检测结果（表1）表明，不同贮藏方式对种子活力的影响差异显著，新鲜种子活力最高，其次是4 ℃冷藏种子，常温贮藏种子活力最低。常温贮藏的红天麻种子与乌天麻种子活力分别降低到55.09%和55.37%，4 ℃冷藏的红天麻种子和乌天麻种子活力分别降低到70.21%和69.54%，两种天麻之间差异不显著。

2.2天麻种子自然萌发过程

红天麻、乌天麻两种天麻种子在自然条件下，种子萌发率低、死亡率高，不同贮藏方式的两种天麻种子经历了相同的变化过程：种胚正常、种胚变色（黑色、红褐色）、种胚消解，变色种胚的种子失去了活力不能正常萌发，并最终消解。两种天麻种子吸收水分都发育至种胚膨大阶段，随后大部分种子停止生长；少部分种子萌发生长（图1）。根据天麻种子萌发过程中形态大小及结构分化情况将天麻种子萌发生长发育过程划分为5个阶段[24，25]。天麻种子萌发的5个阶段为种胚未变化（阶段0）、种胚膨大而尚未突破种皮（阶段1）、种胚膨大突破种皮（阶段2）、种胚出现分生原基（阶段3）、芽体形成（阶段4），其中阶段0的种子未萌发，阶段1、2、3、4为种子已萌发。

2.3不同贮藏方式对天麻种子死亡率的影响

由表2可知，3种不同贮藏方式的两种天麻种子在8～12月死亡率都呈上升趋势，8月种子死亡率最低，12月种子死亡率最高。红天麻种子在4 ℃冷藏和常温贮藏下其各月死亡率差异均达到显著水平，新鲜种子各月死亡率均较低；乌天麻新鲜种子各月死亡率差异均达到显著水平，常温贮藏种子死亡率除9月和10月间差异不显著外，其他月份间差异也均达到显著水平。此外，3种不同贮藏方式的两种天麻种子的死亡率在各月都是常温贮藏种子死亡率显著高于4 ℃冷藏种子和新鲜种子，4 ℃冷藏种子显著高于新鲜种子。相同贮藏方式下的两种天麻种子，除10月的常温贮藏种子外，其他各贮藏方式下的乌天麻种子各月死亡率均高于红天麻。

2.4不同贮藏方式对天麻种子萌发率的影响

由表3可知，3种不同贮藏方式的两种天麻种子在8～12月的萌发率总体呈下降趋势，8月种子萌发率最高，12月种子萌发率最低。红天麻种子在常温贮藏条件下除10月和11月间种子萌发率差异不显著外，其他月份间差异显著，4 ℃冷藏种子和新鲜种子的萌发率各月间差异均达到显著水平；3种不同贮藏方式的乌天麻种子在各月间的差异均达到显著水平。此外，除红天麻8月和11月4 ℃冷藏种子和新鲜种子差异不显著外，其他月份两种天麻均是4 ℃冷藏种子萌发率显著高于新鲜种子，新鲜种子各月的萌发率显著高于常温贮藏种子。

2.5不同贮藏方式对天麻种子萌发生长指数的影响

由表4可知，不同贮藏方式的两种天麻种子在8～12月的萌发生长指数变化趋势一致，均呈先上升后下降的变化趋势，9月萌发生长指数达到最高。此外，在相同贮藏条件下的两种天麻种子，除8月和9月的4 ℃冷藏种子外，乌天麻种子各月萌发生长指数均高于红天麻。两种红天麻种子各贮藏方式间差异也均达显著水平。

3结论与讨论

3.1结论

天麻种子6月播种后，8月萌发率最高，9月萌发生长指数最高，12月死亡率最高；4 ℃冷藏有利于提高种子的萌发率。因此在6月选择新鲜种子或短时间冷藏种子播种有利于种子的萌发，在9月利于采样，可以获得理想的萌发菌分离材料。

3.2讨论

1）天麻种子在6月播种，8月萌发率高、死亡率低，9月种子萌发生长指数较高。这主要因为每年的5～7月是雨季，天麻原生地此时的空气湿度在85%左右，土壤湿度在90%以上，这为种子的萌发提供了充足的水分；此时，天麻原生地平均气温在18～25 ℃之间，是种子最适萌发温度；此时的温湿度也是萌发菌最适合生长的条件[26]，所以此时的萌发菌能侵染充分吸水膨大的天麻种子与其形成共生体系，为其提供养分，从而促进种子的萌发和生长。

2）环境温度和湿度是影响种子保存后种子活力的主要外因。在常温常湿环境下种子劣变较快，主要是因为在常温常湿条件下，种子种皮透性加大，种子体内出现了大量的羟自由基及其衍生物和超氧阴离子，这些物质的积累最终导致种子劣变和衰老速度加快[27]。本研究得出，天麻种子在常温下贮藏其种子活力降低，这一结论与上述研究结果一致，是因为天麻等兰科植物种子在常温下种子种皮通透性加大。有研究者用超低温和超干燥对兰科植物种子保存做了研究，超低温和超干燥都是为了抑制种子体内酶活反应，从而保证种子活力[28，29]。因此，在常温下我们可以尝试用干燥法处理天麻种子，既防止种子霉变又抑制种子体内酶活反应，从而保证种子活力。

3）幼嫩的原球茎在天麻生命整个过程中是最薄弱的环节，大量的个体会在早期因养分不足及外界环境因素的影响，如温度、湿度、病虫害等夭亡[26]。本研究发现，天麻种子死亡大多是在早期原球茎阶段；此阶段的原球茎种皮透性加大、种胚新陈代谢活跃，因没有及时地与萌发真菌接触形成共生获得养分而饥饿，加上外界环境不利因素的影响导致原球茎抵抗环境能力弱而死亡。因此，在选择播种样地时，有针对性地选择有野生天麻生长、生境通风性好、落叶腐殖层透水透气较好的样地，将有助于降低种子死亡率。

4）兰科植物种子在自然条件下萌发率很低，影响其萌发的因素有种皮机械阻力和透水透气性差、种胚发育不完全、营养物质过少以及存在抑制物质[30]。在自然条件下，兰科植物种子的萌发必须依靠真菌的侵染来完成，但萌发率非常低。天麻种子呈粉末状，在显微镜下观察，种子呈纺锤形，结构比较简单，由1层透明的种皮和1个种胚组成，需要真菌侵染为其提供养分才能萌发，因此在自然条件下，天麻种子萌发率很低。相关研究表明，成熟的兰科植物种子采集后保存在4 ℃黑暗环境中，有助于打破种子的休眠，提高种子的萌发率[13，25，31]。本研究得出，天麻种子在4 ℃冷藏20 d后，种子的萌发率高于新鲜种子，这与上述研究结果一致，是因为天麻等兰科植物种子在成熟的过程中种子生理和结构发生了变化，在生理上将形成休眠机制，在结构上形成一层不渗透结构[13，25]，因此打破种子休眠机制和不渗透结构，提高种子萌发率是关键，选用低温保存可以打破种子休眠机制，提高种子萌发率。

5）天麻野生资源保护抚育是根据天麻植物生长特性及对生态环境条件的要求，在其原生境或相似的环境中，通过人为的介入增加种群数量，从而保持群落生态平衡的一种方式。本研究得出，天麻种子在6月播种，8月有较低的死亡率和较高的萌发率，9月有较高的萌发生长指数，其生长周期较长，当年可获得次生原球茎，所以在天麻野生资源保护抚育时，可人为提早升温让天麻抽薹开花，在4～5月完成天麻种子播种，这样天麻就有较长的生长周期，在当年可得到更多的原球茎来分离萌发菌；同样，在天麻有性繁殖栽培产业中可提前升温，使天麻的生长周期比天麻正常抽薹开花种植多1～2个月，从而提高当年的天麻产量。

本研究未对室内温度和湿度进行测定，也没有定期对保存种子进行活力检测，所以本次试验结果不能说明天麻种子在自然状态下种子活力变化规律，也不能说明天麻种子在自然条件下或生产上可允许保存的最长时间，所以用什么样的条件保存天麻种子既能保证其种子活力，又能提高天麻种子萌发率，是值得研究的。

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