菲降解菌株的分离、鉴定及其降解条件的研究

王莉+史鹏+丁文利+闫晓宁+陈卫民

摘要：利用平板升华法从陕北王家川采油厂污染土壤中筛选出3株对菲具有降解活性的菌株F13、F14和FQ20，并对它们降解菲的特性及各种影响因素进行了研究。结果表明，在菲浓度为50 mg/L的条件下，F13在39 ℃、pH为9、36 h后降解率达到最高值94%；F14在36 ℃、pH为11、36 h后降解率达到最高值89%；FQ20在36 ℃、pH为9、30 h后降解率达到最高值87%。根据形态观察和16S rDNA序列分析，鉴定F13、F14、FQ20分别为分支杆菌（Mycobacterium vanbaalenii）、戴尔福特菌（Delftia tsuruhatensis）、敏捷食酸菌（Acidovorax facilis），其16S rDNA序列相似性分别为99.93%、99.27%和99.01%。

关键词：生物降解；菲；多环芳烃

中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）10-2264-04

Isolation and Identification of Phenanthrene-degrading Bacteria and

Its Degradation Conditions

WANG Li，SHI Peng，DING Wen-li，YAN Xiao-ning， CHEN Wei-min

（College of Life Sciences， Northwest Agriculture and Forestry University， Yangling 712100， Shaanxi， China）

Abstract： Phenanthrene-degrading bacteria F13， F14， FQ20 were isolated from heavy oil contaminated soil at Wangjiachuan oil production factory in the north of Shaanxi province by plating sublimation method. Their abilities for phenanthrene degradation were studied and the various influencing factors were analyzed. The results showed that phenanthrene （50 mg/L） degradation rate for F13 was 94% when pH was 9 after 36 hours rotary culture at 39 ℃. Phenanthrene（50 mg/L） degradation rate for F14 was 89% when pH was 11 after 36 hours rotary culture at 36 ℃. Phenanthrene（50 mg/L） degradation rate for FQ20 was 87% when pH was 9 after 30 hours rotary culture at 36 ℃. F13， F14， FQ20 were further identified as Mycobacterium vanbaalenii， Delftia tsuruhatensis and Acidovorax facilis by the 16S rDNA sequencing analysis. The sequence similarities of F13， F14， FQ20 were 99.93%， 99.27% and 99.01%， respectively.

Key words： biodegradation； phenanthrene； polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）

基金项目：国家高技术研究发展计划项目（2012AA101403）

多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）指含有一个以上苯环的芳香化合物，可分为芳香稠环型和芳香非稠环型，是煤、石油、木材、烟草、有机高分子化合物等有机物热解或不完全燃烧时产生的挥发性碳氢化合物。随着经济的发展、化石燃料消耗量的日益增加和工业“三废”的大量排放，环境中PAHs的分布量与日俱增，已经广泛存在于人类生活的自然环境中，如大气、水体、土壤、作物和食品，目前已知的PAHs约有200多种。由于PAHs具有很强的致畸、致癌、致突变作用，极大地威胁着人类的健康，因此现在PAHs的监测越来越受到人们的重视，也是各国优先控制的一类污染物[1-3]。

菲是一种芳香稠环型PAHs，由3个苯环成一定角度联结而成，兼具K区和湾区结构，因而其抗降解能力很强，容易在土壤环境中富集，菲在土壤中的吸附对其在环境中的迁移转化和归宿起着重要的作用。近年来随着土壤PAHs的污染状况越来越严重，菲的分布、来源、结构、理化性质以及各种处理方法都成为了当前的研究热点之一。目前国内外很多学者正致力于将PAHs作为碳源或能源，利用自然环境中特定的菌株或菌群对其降解，探明PAHs的生物降解机理和共代谢的方式，探索更有效的生物修复技术[4]。

本试验通过对采自陕北王家川采油厂污染的土壤进行富集培养，分离获得了3株以菲为惟一碳源的高效降解细菌，并对其降解菲的特性及其系统发育进行了初步研究，为PAHs污染土壤环境风险的科学评价、农产品的安全生产和PAHs污染土壤微生物降解和修复提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试土壤样品采自陕北王家川采油厂东二区附近受石油污染土壤，取地表及以下10 cm的土层。

1.1.2培养基分离纯化培养基（无机盐培养基，MS）[5]：（NH4） 2SO4 2 g/L，KH2PO4 2 g/L， Na2HPO4 2 g/L，FeCl3 0.02 g/L，自然pH；富集培养基：无机盐培养基（MS）+50 mg/L的菲；降解试验所用培养基：配方同分离纯化培养基（不含琼脂）；菌种斜面保存培养基（牛肉膏蛋白胨培养基，NR）：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，琼脂20 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0～7.2。

1.2试验方法

1.2.1菲高效降解细菌的富集分离及菌悬液的制备[6] 取50 g土样于250 mL菲降解培养基中，并加入50 mg/L的菲作为惟一碳源，28 ℃、140 r/min、遮光振荡培养。7 d后取200 μL接种于相同的新鲜培养基，相同条件下再培养7 d，最后将培养物适当稀释，涂平板。本试验采用平板升华法进行选择性分离，具体步骤如下：把接种后的平板倒扣到底部平铺有固体菲的500 mL烧杯上，用封口膜将接口处密封，整体放到电炉上加热（约至100 ℃），并在平板上方放置冰袋，使菲升华后遇平板冷却附着其上，约5 min后取下平板，37 ℃恒温培养箱培养7 d，挑取能产生透明圈的单菌落纯化。

1.2.2菌体生物量浓度的测定方法待测培养液中加入乙酸乙酯，于分液漏斗中充分振荡，萃取。取下层菌体溶液，以不加菲的接菌培养液为空白对照，在600 nm下测定吸光度。

1.2.3菲降解效率的测定定时整瓶提取培养液，经环己烷萃取，并用硅胶G薄层层析法分离，石油醚溶解提取后，在252 nm测定紫外吸光度，以菲标准溶液建立标准曲线，得出培养液中的菲浓度。菲降解率计算公式：

T=（A-B）/A×100%

式中T为降解率（%），A为未接菌降解试验用培养基中菲浓度（mg/L），B为接菌培养后降解试验用培养基（降解液）中菲浓度（mg/L）[7]。

1.2.4不同因素对F13、F14、FQ20降解菲效能的影响①不同时间的降解。菲质量浓度为50 mg/L的降解培养基中，1%的接种量，pH为7、28 ℃、140 r/min条件下振荡培养，分别于18、24、36、48、60、72和96 h后测定菲浓度和菌体生物量浓度，绘制生长曲线。②不同 pH 的降解。将菲质量浓度为50 mg/L的降解培养基的pH分别调至3、5、6、7、8、9、11，在 1%的接种量，28 ℃、140 r/min条件下振荡培养48 h后测定菲浓度和菌体生物量浓度，绘制生长曲线。③不同温度的降解[8-10]。分别在28、30、36、39和42℃下，在1%的接种量，菲浓度为50 mg/L，pH为7、140 r/min 条件下，振荡培养48 h后测定菲浓度和菌体生物量浓度，绘制生长曲线。

1.2.5分离菌株的鉴定①对菌株进行菌体形态观察和革兰氏染色检验。②总DNA的提取：供试菌株接种于培养液中，28 ℃、140 r/min振荡培养至对数中期，8 000 r/min离心收集菌体，用TE溶液（10 mmol/L Tris和1 mmol/L EDTA，pH 8.0）洗涤3次，溶菌酶破壁，蛋白酶处理，酚/氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀，风干，最后溶于双蒸水中。用1%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白吸光值检测DNA样品的浓度和纯度[11]。③菌株16S rDNA的PCR扩增、测序：以总DNA为模板，选用来源于E. coli 16S rDNA基因序列保守区域的两段引物P1和P6为正向引物和反向引物，其中P1序列为5′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′，P6序列为5′-CGGGATCCTA-CGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共34个循环；最后72 ℃再延伸7 min，PCR 扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20 ℃保存[11]，测序工作由上海生工生物工程技术有限公司完成。④16S rDNA序列数据处理和系统发育树构建。将16S rDNA的全序列与从GenBank（NCBI）中获得的已知模式菌种进行多重序列比较，用SeqPup 0.5软件录入，数据经编辑后用DNAstar和MEGA软件包分析，采用Neighbor-joining方法构建以16S rDNA全序列为基础的系统发育树，使用EzTaxon server 2.1比对测试菌株间16S rDNA序列的相似性值。

2结果与分析

2.1菌株的分离筛选

将菌株经过2次富集驯化，在附着菲的培养基上培养，挑选可形成明显透明圈且透明圈较大的菌株为高降解活性菌，命名为F13、F14、FQ20。

2.2菌株对菲的降解效能

2.2.1时间对菲降解的影响由图1可知，在接种72 h后菲降解率达到最高，F13、F14、FQ20降解率分别为66%、61%、60%。菌株F13和F14在接种后的48～60 h间生长最快，菌株FQ20在接种后的24～36 h间生长最快，推测该时期为相应菌体生长的指数期，其后生长变得缓慢或者有所下降。

2.2.2pH对菲降解的影响分析图2可知，3种菌株均在碱性环境下生长良好，F14在pH为11时，F13和FQ20在pH为9时，菌体浓度都达到相应的最大值；F13和FQ20在pH为9时降解率达到最大，分别为86%和80%；F14在pH为11时达到最大值75%，而在酸性条件下几乎无降解，说明该菌的适用pH范围偏碱性。

2.2.3培养温度对菲降解的影响由图3可知，温度为39 ℃时，菌株F13对菲的降解率最高，为88%；温度为36 ℃时，菌株F14、FQ20对菲的降解率最高，分别为70%和81%。温度影响菌株降解菲的因素可能有两个方面，一方面环境温度的变化会影响菌株的代谢速率，最适生长温度下，菌体浓度高降解率随之增加；另一方面随着温度的上升，菲的溶解度增大容易被菌体利用。

2.2.4最佳条件下菌株对菲的降解率如图4为菌株在最佳条件下对菲的降解速率和菌体生物量OD600 nm。针对不同的菌株，将培养条件调至相应的最佳降解条件，F13在39 ℃、培养基pH为9，培养36 h后降解率达到最高，为94%，菌体生物量OD600 nm为0.52；F14在36 ℃、培养基pH为11，培养36 h后，降解率达到最高，为89%，菌体生物量浓度为0.49；FQ20在36 ℃、培养基pH为9，培养30 h后，降解率达到最高，为87%，菌体生物量OD600 nm为0.58。

2.3 菌株的鉴定

2.3.1菌落形态及革兰氏染色菌株F13的菌落呈黄色，表面光滑湿润，边缘齐整，不透明；菌株F14的菌落呈白色，表面光滑湿润，边缘齐整，透明；菌株FQ20的菌落呈白色，表面光滑湿润，边缘齐整，不透明。经革兰氏染色初步鉴定均为阳性菌。

2.3.216S rDNA序列测序结果分析将所获得的DNA序列提交至GenBank数据库进行比对，用SeqPup 0.5软件录入，数据经编辑后用DNAstar和MEGA软件包分析，采用 Neighbor-joining方法构建系统发育树（图5），发现F13与Mycobacterium vanbaalenii PYR-1的相似性最高，为99.93%；F14与Delftia tsuruhatensis T7的相似性最高，为99.27%；FQ20与Acidovorax facilis DSM649的相似性最高，为99.01%。

3小结与讨论

从菲污染的土壤中分离筛选高效降解菲的菌株，是开展菲污染土壤的生物修复的基础[12]。基于此，本研究从受石油严重污染的土壤中分离得到了3株对菲具有高效降解能力的菌株F13、F14、FQ20。研究表明3种菌株的生长环境均偏碱性，对热均有一定的耐受性。不同菌株对环境介质的pH和温度的最适要求存在差异，主要体现在对PAHs生物可利用性的改变程度和对微生物群落结构和功能酶活性上存在差异[12-15]。

菲在自然条件下的降解过程受多种环境因子和营养元素的协同影响。例如生物表面活性剂的存在能够降低菲在环境中的毛细管张力从而促进菲的溶解，提高微生物的利用率，从而提高菲的降解率[4，15，16]。

石油污染土壤中存在着具有降解菲能力的不同属的微生物，部分是难以人工培养的。应该进一步结合免疫培养法，全面研究降解菲及其他PAHs的微生物，把握每个属降解菲的机理以及不同属之间、属与环境之间的相互作用。同时，进一步考虑多底物的存在对PAHs的微生物利用方式及其共代谢现象，以便更好地进行生物修复。近年来，采用细胞融合技术等遗传工程手段将多种降解基因转入同一微生物中是研究热点，以期获得基因工程菌使之具备广谱性的降解能力，但提高这种基因工程菌存活能力的研究有待进一步深入。

参考文献：

[1]ZHU L Z， GAO Y Z. Prediction of phenanthrene uptake by plants with a partition-limited model[J]. Environmental Pollution，2004，131（3）：505-508.

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[14]周启星. 污染土壤修复的技术再造与展望[J]. 环境污染治理技术与设备，2002，3（8）：36-40.

[15]MUSAT F， GALUSHKO A， JACOB J， et al. Anaerobic degradation of naphthalene and 2-methylnaphthalene by strains of marine sulfate-reducing bacteria[J]. Environmental Microbiology，2009，11（1）：209-219.

[16]邹德勋，骆永明，滕应，等. 多环芳烃长期污染土壤的微生物强化修复初步研究[J].土壤，2006，38（5）：652-656.

2.2.4最佳条件下菌株对菲的降解率如图4为菌株在最佳条件下对菲的降解速率和菌体生物量OD600 nm。针对不同的菌株，将培养条件调至相应的最佳降解条件，F13在39 ℃、培养基pH为9，培养36 h后降解率达到最高，为94%，菌体生物量OD600 nm为0.52；F14在36 ℃、培养基pH为11，培养36 h后，降解率达到最高，为89%，菌体生物量浓度为0.49；FQ20在36 ℃、培养基pH为9，培养30 h后，降解率达到最高，为87%，菌体生物量OD600 nm为0.58。

2.3 菌株的鉴定

2.3.1菌落形态及革兰氏染色菌株F13的菌落呈黄色，表面光滑湿润，边缘齐整，不透明；菌株F14的菌落呈白色，表面光滑湿润，边缘齐整，透明；菌株FQ20的菌落呈白色，表面光滑湿润，边缘齐整，不透明。经革兰氏染色初步鉴定均为阳性菌。

2.3.216S rDNA序列测序结果分析将所获得的DNA序列提交至GenBank数据库进行比对，用SeqPup 0.5软件录入，数据经编辑后用DNAstar和MEGA软件包分析，采用 Neighbor-joining方法构建系统发育树（图5），发现F13与Mycobacterium vanbaalenii PYR-1的相似性最高，为99.93%；F14与Delftia tsuruhatensis T7的相似性最高，为99.27%；FQ20与Acidovorax facilis DSM649的相似性最高，为99.01%。

3小结与讨论

从菲污染的土壤中分离筛选高效降解菲的菌株，是开展菲污染土壤的生物修复的基础[12]。基于此，本研究从受石油严重污染的土壤中分离得到了3株对菲具有高效降解能力的菌株F13、F14、FQ20。研究表明3种菌株的生长环境均偏碱性，对热均有一定的耐受性。不同菌株对环境介质的pH和温度的最适要求存在差异，主要体现在对PAHs生物可利用性的改变程度和对微生物群落结构和功能酶活性上存在差异[12-15]。

菲在自然条件下的降解过程受多种环境因子和营养元素的协同影响。例如生物表面活性剂的存在能够降低菲在环境中的毛细管张力从而促进菲的溶解，提高微生物的利用率，从而提高菲的降解率[4，15，16]。

石油污染土壤中存在着具有降解菲能力的不同属的微生物，部分是难以人工培养的。应该进一步结合免疫培养法，全面研究降解菲及其他PAHs的微生物，把握每个属降解菲的机理以及不同属之间、属与环境之间的相互作用。同时，进一步考虑多底物的存在对PAHs的微生物利用方式及其共代谢现象，以便更好地进行生物修复。近年来，采用细胞融合技术等遗传工程手段将多种降解基因转入同一微生物中是研究热点，以期获得基因工程菌使之具备广谱性的降解能力，但提高这种基因工程菌存活能力的研究有待进一步深入。

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2.2.4最佳条件下菌株对菲的降解率如图4为菌株在最佳条件下对菲的降解速率和菌体生物量OD600 nm。针对不同的菌株，将培养条件调至相应的最佳降解条件，F13在39 ℃、培养基pH为9，培养36 h后降解率达到最高，为94%，菌体生物量OD600 nm为0.52；F14在36 ℃、培养基pH为11，培养36 h后，降解率达到最高，为89%，菌体生物量浓度为0.49；FQ20在36 ℃、培养基pH为9，培养30 h后，降解率达到最高，为87%，菌体生物量OD600 nm为0.58。

2.3 菌株的鉴定

2.3.1菌落形态及革兰氏染色菌株F13的菌落呈黄色，表面光滑湿润，边缘齐整，不透明；菌株F14的菌落呈白色，表面光滑湿润，边缘齐整，透明；菌株FQ20的菌落呈白色，表面光滑湿润，边缘齐整，不透明。经革兰氏染色初步鉴定均为阳性菌。

2.3.216S rDNA序列测序结果分析将所获得的DNA序列提交至GenBank数据库进行比对，用SeqPup 0.5软件录入，数据经编辑后用DNAstar和MEGA软件包分析，采用 Neighbor-joining方法构建系统发育树（图5），发现F13与Mycobacterium vanbaalenii PYR-1的相似性最高，为99.93%；F14与Delftia tsuruhatensis T7的相似性最高，为99.27%；FQ20与Acidovorax facilis DSM649的相似性最高，为99.01%。

3小结与讨论

从菲污染的土壤中分离筛选高效降解菲的菌株，是开展菲污染土壤的生物修复的基础[12]。基于此，本研究从受石油严重污染的土壤中分离得到了3株对菲具有高效降解能力的菌株F13、F14、FQ20。研究表明3种菌株的生长环境均偏碱性，对热均有一定的耐受性。不同菌株对环境介质的pH和温度的最适要求存在差异，主要体现在对PAHs生物可利用性的改变程度和对微生物群落结构和功能酶活性上存在差异[12-15]。

菲在自然条件下的降解过程受多种环境因子和营养元素的协同影响。例如生物表面活性剂的存在能够降低菲在环境中的毛细管张力从而促进菲的溶解，提高微生物的利用率，从而提高菲的降解率[4，15，16]。

石油污染土壤中存在着具有降解菲能力的不同属的微生物，部分是难以人工培养的。应该进一步结合免疫培养法，全面研究降解菲及其他PAHs的微生物，把握每个属降解菲的机理以及不同属之间、属与环境之间的相互作用。同时，进一步考虑多底物的存在对PAHs的微生物利用方式及其共代谢现象，以便更好地进行生物修复。近年来，采用细胞融合技术等遗传工程手段将多种降解基因转入同一微生物中是研究热点，以期获得基因工程菌使之具备广谱性的降解能力，但提高这种基因工程菌存活能力的研究有待进一步深入。

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