牛奶中青霉素G及青霉噻唑酸的UPLC－MS／MS法测定

刘 静，郑增忍，赵思俊，曲志娜，王君玮，孙晓亮，谭维泉，刘 坤，曹旭敏，邹 明

（1.青岛农业大学，山东青岛266109；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032）

青霉素G（penicillin G）属于β－内酰胺类抗生素，价格低廉，疗效显著，常用于治疗奶牛乳腺炎、子宫内膜炎等常见奶牛疾病。然而药物的不合理使用会在牛奶中造成残留，青霉素G化学结构中的β－内酰胺环不稳定，容易发生酶解，产生以青霉噻唑酸为主的代谢产物。牛奶中残留的青霉素G或青霉噻唑酸会成为青霉素过敏患者的过敏原，引起患者的过敏反应，甚至造成过敏性休克危及患者生命安全［1］。为保护消费者的安全，食品法典委员会、欧盟、美国和我国农业部等均对牛奶中青霉素G的最高残留限量（maximum residue limits，MRLs）为4μg／kg，青霉噻唑酸的 MRLs尚未规定［2］。建立青霉素G及代谢产物快速而灵敏的检测方法，对保护消费者安全具有重要意义。

动物性食品中β－内酰胺类抗生素残留的检测方法已有报道［3－5］，但同时对青霉素G和青霉噻唑酸进行研究的报道较少。Kress C等［6］研究了酶联免疫吸附试验测定羊奶中的青霉噻唑酸，该方法适用于样品的大量筛选，不适用于确证检测。陈聪等［7］研究了测定血浆中青霉素G及代谢物的超高效液相色谱－串联质谱法，研究了青霉素G及代谢产物的消除规律。刘创基等［8］研究了超高效液相色谱－串联质谱法测定牛肉中青霉素类药物及代谢产物残留的方法，采用乙腈匀浆提取，正己烷去脂的方法，样品处理过程复杂。冯月超等［9］建立了牛奶中青霉素G和青霉噻唑酸的超高效液相色谱串联质谱法，药物回收率为92%～103%，青霉素G的定量限5 μg／kg，超过了国家对牛奶中青霉素 G的规定MRLs，且该方法未消除牛奶基质对检测结果的影响。本试验在此基础上采用超高效液相色谱－串联质谱法（UPLC－MS／MS）对牛奶中青霉素G及青霉噻唑酸同时进行测定，优化样品的前处理方法，对基质效应的影响进行研究和消除，为快速准确的检测该类药物提供可靠的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主 要 仪 器 设 备 AcquityTMUPLC－Xevo TQMS超高效液相色谱－串联质谱仪、Oasis HLB固相萃取柱，美国 Waters公司产品；N2蒸发仪，美国Organomation Associates公司产品；QL－866型漩涡混合器，海门其林贝尔仪器制造有限公司产品；J2－21型高速冷冻离心机，美国Backman公司产品；HY－5型回旋振荡器，常州国华电器有限公司产品；Q－纯水仪，美国Millipore公司产品。

1.1.2 主要试剂 青霉素 G（penicillin G，纯度99.5%），德国 Dr.Ehrenstorfer公司产品；青霉噻唑酸（benzylpenicillin acid纯度98.6%），英国LGC公司产品；甲醇、甲酸、乙腈（色谱纯），德国 Merck公司产品；高纯水（Millipore，17.9MΩ·cm）、乙醇、甲酸铵（分析纯），国药集团化学试剂有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 标准储备液的配置，即准确称取青霉素G及青霉噻唑酸标准品到10mL棕色容量瓶中，分别用500mL／L乙腈水溶解并定容，配成1 000μg／mL的标准储备液，置－20℃冷藏保存。临用前用500mL／L乙腈水稀释至工作浓度标准溶液。

1.2.2 UPLC－MS／MS条件

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱为 Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100mm ×2.1mm，1.7μm ），流动相A为1mL／L甲酸溶液，B为乙腈溶液，进样量5μL，柱温35℃，流速0.3mL／min，梯度洗脱程序如表1所示。

1.2.2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI＋），正离子扫描，多反应监测（MRM）模式，毛细管电压：2.5kV；离子源温度150℃，雾化器流1 000L／h，锥孔气流50L／h，雾化室温度500℃（表2）。

表1 分离青霉素G及青霉噻唑酸的梯度洗脱程序Table 1 The gradient elution of penicillin G and benzylpenicillin acid

表2 青霉素G及其青霉噻唑酸的质谱检测参数Table 2 The mass spectrum detection parameters of penicillin G and benzylpenicillin acid

1.2.3 牛奶样品的前处理

1.2.3.1 提取 取空白牛奶加标样品2mL于50mL离心管中，加入6mL乙腈∶乙醇（3∶1，V∶V）的混合溶液，涡旋混匀，振荡提取20min，以10 000r／min离心5min，上清液转移洁净试管内，50℃ 下 N2吹干，用3mL 0.01mol／L 甲酸铵（pH8.5）溶解，待用。

1.2.3.2 净化 将溶液加入到用3mL甲醇活化，3mL水和3mL 0.01mol／L甲酸铵（pH8.5）平衡的HLB固相萃取柱中，依次用2mL 0.01mol／L甲酸铵（pH8.5）和1mL水淋洗，抽干，经3mL乙腈洗脱后，收集洗脱液，50℃下N2吹干。残余物用1mL 200mL／L乙腈水复溶，过0.2μm滤膜，供 UPLCMS／MS测定。

1.2.4 标准曲线的绘制

1.2.4.1 标准品直接稀释 用200mL／L乙腈水稀释标准品，制备系列标准溶液，进行UPLC－MS／MS分析，以定量离子的峰面积为纵坐标（y），标准品添加浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，并求回归方程和相关系数。

1.2.4.2 基质添加校正曲线 取2mL空白牛奶于50mL离心管中，按照1.2.3方法进行处理，用200 mL／L乙腈水复溶后稀释标准品，制备系列标准溶液，进行UPLC－MS／MS分析，以定量离子的峰面积为纵坐标（y），标准品添加浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，并求回归方程和相关系数。

1.2.5 基质效应的测定 本研究按照Matuszewski B K等［10］提出的方法评价基质效应的大小。青霉素G及青霉噻唑酸标准品用200mL／L乙腈水直接稀释后测得的峰面积为S1。空白牛奶按照1.2.3方法处理，用200mL／L乙腈水复溶后稀释标准品，测得的峰面积为S2，则基质效应ME%＝S2／S1×100%。本试验选取5、10、20、50、100μg／kg等浓度对基质效应进行测定。

1.2.6 基质效应的消除 按照1.2.4.2方法制备基质添加校正曲线，并求出回归方程，对试验检测样品的检测结果进行校正。

1.2.7 稳定性研究 取空白牛奶按照1.2.3方法处理，200mL／L乙腈水复溶，青霉素G和青霉噻唑酸添加4μg／kg标准品（青霉噻唑酸MRL未规定，添加浓度同青霉素G），做6个平行，置于4℃和室温（20℃～25℃）环境下0、24、48h后，进行检测。

1.2.8 实际样品测定 购买市场上的20份牛奶按照1.2.3方法处理，用200mL／L乙腈水复溶，过膜后上机检测，对样品中的青霉素G和青霉噻唑酸的含量进行测定。

2 结果

2.1 线性范围与检测限

空白牛奶按照1.2.3方法处理，用200mL／L乙腈水复溶后稀释标准品，制备系列标准工作溶液，定量离子的峰面积为纵坐标（y），标准品添加浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，结果显示相关系数均大于0.99，线性良好。

空白牛奶添加不同浓度的标准品，涡旋混匀，室温放置10min，按照1.2.3方法进行处理，UPLC－MS／MS测定，信噪比为3h和10h对应的浓度分别为检测限和定量限（表3）。本方法灵敏度高、线性良好、能够满足食品中兽药残留分析的要求。

表3 方法的线性范围和检测限Table 3 Linearity range and detection limits for penicillin G and benzylpenicillin acid

2.2 基质效应的大小

本研究按照Matuszewski B K等［10］提出的方法评价基质效应的大小。当ME＝100%时，表明不存在基质效应；当ME＞100%时，表明样品基质对分析物的检测结果有增强作用；当 ME＜100%时，表明样品基质对分析物的检测结果有抑制作用。实验结果显示在检测范围内，青霉素G和青霉噻唑酸的ME分别为91.02%～96.08%、91.93%～97.67%，表明基质对青霉素G和青霉噻唑酸存在不同程度的抑制作用，相同添加浓度下对青霉素G的抑制作用稍强于青霉噻唑酸，且药物浓度越低，基质效应的影响越大（图1）。生物组织中药物的残留浓度一般较低，多为痕量检测，因此在检测过程中需要考虑基质效应对结果的影响。

图1 基质效应结果Fig.1 Matrix effect results

2.3 方法的回收率和精密度

用空白牛奶样品在低、中、高3个水平进行加标回收和精密度试验，样品添加不同浓度的标准溶液，涡旋混匀，静置10min，按照1.2.3进行处理，UPLC－MS／MS进行检测，基质添加曲线进行校正，其回收率和精密度结果见表4。样品的加标回收率为75.88%～106.01%，变异系数为6.65%～14.17%，符合兽药残留分析的要求。

2.4 稳定性研究

以初次检测的平均色谱峰面积为标准，计算不同温度下间隔一定时间后的药物含量回收率。试验结果显示，在4℃环境中，间隔24h和48h后青霉素G的回收率分别为96.97%和90.31%，青霉噻唑酸的回收率分别为91.63%和84.69%。在室温条件下，青霉素G的回收率分别为88.76%和86.98%，青霉噻唑酸的回收率分别为84.12%和85.51%。结果表明两种化合物均会随放置时间的增长而发生降解，且室温条件下降解速度较快，所以样品处理后的保存需要考虑温度的影响。现实中经常遇到不能立即检测现象，本方法的灵敏度低，MRL浓度的样品处理后，4℃保存48h，仍在本方法检测范围之内，可提供一定程度的灵活性，但试验结果的检测浓度会受到一定影响，所以样品处理后应尽快检测，获得最准确可靠的结果。

表4 方法的加标回收率和精密度Table 4 Recoveries and RSDs for penicillin G and benzylpenicillin acid

2.5 实际样品测定

本试验方法对购买的20份牛奶样品进行检测，检测结果显示。所购牛奶中均不含青霉素G及青霉噻唑酸残留。

3 讨论

3.1 UPLC－MS／MS的优化

用200mL／L乙腈水分别配制浓度为1μg／mL的青霉素G和青霉噻唑酸标准溶液。在电喷雾正离子模式（ESI＋）下进行全扫描，观察MSTune界面的［M＋H］＋峰的响应强度，选择丰度较大的分子离子峰作为母离子，然后对其进行子离子扫描（Daughter Scan），获得碎片离子峰，从中选择响应较强的一对离子，其中较高的作为定性离子。对其质谱参数进行优化后，获得的质谱条件见表2。

在色谱分析中，流动相中的有机相多选择甲醇或乙腈［5，7－8］，但甲醇含有羟基，可能与青霉素类药物发生醇解，故本试验选择乙腈为有机相。采用正离子模式进行质谱检测时，流动相中添加甲酸有助于分析物的质子化，而pH太低，则可能对药物的保留和稳定性产生影响。故本试验参考相关文献［8－9，14］，流动相选用1mL／L甲酸水和乙腈，梯度洗脱进行分离，色谱条件见表1。图2为最优条件下青霉素G和青霉噻唑酸标准品10μg／kg的色谱图。图中可以看出优化条件后，目标物质质谱响应高，峰形理想，达到试验检测的要求。

3.2 样品前处理方法的优化

牛奶样品前处理通常会有除蛋白及除脂肪两个关键步骤，提取青霉素类药物的常用提取溶剂有乙腈［11］、酸化乙腈、乙醇等［11－13］，个别文献采用无机溶剂如乙酸锌－亚铁氰化钾，乙酸铅－草酸钾－磷酸氢二钠等［14］，由于β－内酰胺环不稳定，可能会使目标化合物分解。因此本试验选择了乙腈、乙醇及不同比例（V∶V，3∶1，1∶1）的乙腈－乙醇混合溶液进行试验，试验结果显示相同的用量时，乙醇和乙腈－乙醇（V∶V，1∶1）的沉淀效果不理想，相同用量条件下，乙腈－乙醇（3∶1，V∶V）混合溶液可以获得理想的沉淀效果和回收效率，且减少了乙腈的用量，所以本试验选用乙腈－乙醇（3∶1，V∶V）混合溶液作为提取液。

参考有关文献［8，12］对青霉素G和青霉噻唑酸的处理方法中，多采用提取液沉淀蛋白，冷冻高速离心去除脂肪的方法。Liu C J等［13］建立牛奶中青霉素及代谢产物的UPLC－MS／MS检测法，牛奶离心后选用乙醇进行提取，离心后上清液旋转蒸干，添加氯化钠防止爆沸，乙酸铵溶解后再次进行高速离心，上清液过膜后进行检测。由于Acquity UPLC色谱柱的填料粒径小、柱体积小、柱压高，所以对样品的净化效果也有更高的要求，上述试验方法中使用氯化钠，可能随样品溶液进入色谱柱，对色谱柱的正常使用造成影响，且该方法样品的处理过程复杂。相关文献［14－15］中，Oasis HLB 柱常被用于β－内酰胺类药物提取液的净化，在样品上样前用pH8.5的0.05 mol／L磷酸缓冲液对Oasis HLB进行平衡。本试验用Oasis HLB柱对提取溶液进行净化，用甲酸铵代替磷酸盐对Oasis HLB柱进行平衡，对甲酸铵的浓度和pH进行优化筛选，试验结果显示甲酸铵溶液的浓度为0.01mol／L，pH8.5时，青霉素 G 和青霉噻唑酸的回收率高于75.88%，满足试验要求。甲酸铵为挥发性盐，不存在堵塞色谱柱的问题，避免了影响仪器正常使用的风险。因此本试验采用乙腈－乙醇混合溶液（V∶V，3∶1）提取牛奶中的青霉素G和青霉噻唑酸后，选用Oasis HLB进行净化，提取净化步骤简单，药物回收率达到75.88%～106.01%，试验结果理想。

3.3 基质效应的消除

牛奶基质成分复杂，选用液质联用技术，尤其是电喷雾离子源用来分析残留药物，往往会发生干扰物质产生离子增强或者抑制的现象，故在方法验证阶段必须进行基质效应的考察。内标法和基质校正添加曲线法定量，都能极大的消除基质效应的影响，在消除基质效应的研究中都有较多应用［15－17］，但内标法需要使用内标化合物，最好是氘代标记化合物，氘代标记化合物价格昂贵，难以获取。因此，本研究选用基质添加校正曲线法消除基质效应，进行定量。此方法操作简单，节约成本，且试验结果稳定，校正后样品加标回收率为75.88%～106.01%，变异系数为6.65%～14.17%，试验结果的重复性与精密度较为理想，满足试验要求。

本研究采用超高效液相色谱－串联质谱法（UPLC－MS／MS），通过对样品提取、净化等条件的优化，选用基质校正添加曲线法进行定量，建立了一种简单、快速的青霉素G和青霉噻唑酸残留的检测方法，此方法灵敏度高、线性范围好、回收率和重现性好，能满足兽药残留检测的要求，可为快速准确的检测该类药物提供可靠的技术支撑。

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